用于建立mtDNA编码基因条件敲除大鼠的方法技术

本发明专利技术提供一种用于建立mtDNA编码基因条件敲除大鼠的方法。利用DdCBE碱基编辑工具，使大鼠mtDNA编码基因密码子TGA(编码氨基酸W)或CAA(编码氨基酸Q)转变为终止密码子TAA，导致翻译提前终止。通过CRISPR/Cas9技术将Cre依赖性表达的LSL

【技术实现步骤摘要】
用于建立mtDNA编码基因条件敲除大鼠的方法


[0001]本专利技术属于动物基因遗传修饰，具体涉及一种大鼠mtDNA编码基因敲除和条件敲除方法。

技术介绍

[0002]线粒体是唯一一个拥有独立于核基因组遗传物质(线粒体DNA，mtDNA)的细胞器。mtDNA编码13个蛋白、22个tRNA和2个rRNA。这13个mtDNA编码的蛋白作为线粒体复合物的核心亚基，对线粒体的稳态维持至关重要。mtDNA突变最终都会影响mtDNA编码蛋白的表达，导致线粒体功能障碍。但是目前还没有一种技术能够成功在体内实现敲除mtDNA编码蛋白。因此，聚焦13个mtDNA编码基因，建立一种在大鼠中敲除和条件敲除mtDNA编码蛋白，为理解mtDNA编码蛋白的生物学功能以及在疾病中的机制对线粒体病的药物研发至关重要。
[0003]近年来，一种基于细菌双链DNA脱氨酶建立的工具—DdCBE，能够成功用于mtDNA的C
·
G到T
·
A碱基的转换。该技术的出现为靶向性建立大鼠mtDNA突变模型提供了可能，利用该技术我们前期成功建立mtDNA突变大鼠模型，并表现出人线粒体疾病表型特征。但是该技术仍未见报道应用于mtDNA编码蛋白的敲除以及用于建立相关动物模型。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是建立一种应用于非治疗或诊断目的的大鼠mtDNA编码基因的敲除和条件敲除的方法。
[0005]根据本专利技术的第一方面，提供一种大鼠mtDNA编码基因敲除方法，包括：
[0006]根据目标基因，选择靠近mtDNA编码基因读码框的5
’
端的密码子TGA或CAA作为DdCBE识别靶标位点，在其上游和下游各选定一个TALE识别序列，两条TALE识别序列之间的间隔长度为7
‑
18bp，其中两个TALE识别靶序列与间隔序列一起限定目标突变序列；
[0007]根据选定的TALE识别靶序列筛选一对DdCBE组合，用于大鼠mtDNA编码基因的敲除和条件敲除。
[0008]大鼠mtDNA编码基因敲除的目标位点和DdCBE组合如下：
[0009]Nd1 G2996：
[0010]MTS
‑
N
‑
1366aa
‑
RVDarray
‑
C
‑
G1333C
‑
UGI+MTS
‑
N
‑
1366aa
‑
RVDarray
‑
C
‑
G1333N
‑
UGI(L1333C+R1333N)
[0011]Nd2 G3992：L1333C+R1333N
[0012]Nd3 C9526：L1397C+R1397N
[0013]Nd4 G10230：L1333C+R1333N
[0014]Nd5 G11938：L1333C+R1333N
[0015]Nd6 G13817：L1333N+R1333C
[0016]Cytb G14365：L1333C+R1333N
[0017]Cox1 G5396：L1333C+R1333N
G11938，Nd6 G13817，Cytb G14365，Cox1 G5396，Cox2 C7021，Cox3 G8645，Atp6 G8121，Atp8 G7783，并设计TALE的识别序列(见图2)。
[0043]根据TALE的识别原则，在靶点上下游分别选定一个TALE识别位点，两个TALE识别位点中间间隔序列为7
‑
18bp，需要包含的目标突变碱基C，同时在间隔序列中避免目标碱基外的碱基C。
[0044]利用两个融合TALE识别位点的DdCBE定位于相应的目标突变序列，并使目标突变G编辑变为A，从而在大鼠mtDNA编码基因中提前引入终止密码子；
[0045]针对大鼠Nd1 G2996，Nd2 G3992，Nd3 C9526，Nd4 G10230，Nd5 G11938，Nd6 G13817，Cytb G14365，Cox1 G5396，Cox2 C7021，Cox3 G8645，Atp6 G8121，Atp8 G7783位点，本专利技术选定的左右两侧TALE识别序列如下：
[0046]Nd1 G2996：
[0047]左侧：TACACTAGCTCTAA(SEQ ID NO.1)
[0048]右侧：GTTATGGAGTGGGGGAA(SEQ ID NO.2)
[0049]Nd2 G3992：
[0050]左侧：CTAGCTCCAACTTACT(SEQ ID NO.3)
[0051]右侧：TAACCTTTATTCGGAAAA(SEQ ID NO.4)
[0052]Nd3 C9526：
[0053]左侧：CCTCATTTCAATTGCATT(SEQ ID NO.5)
[0054]右侧：TGAATATGAGGCTTTTTCG(SEQ ID NO.6)
[0055]Nd4 G10230：
[0056]左侧：GACTCTCAGCCAACAAAA(SEQ ID NO.7)
[0057]右侧：TGGAGGATGTCGAAAGA(SEQ ID NO.8)
[0058]Nd5 G11938：
[0059]左侧：ATATAATTACTAACT(SEQ ID NO.9)
[0060]右侧：TTAAGATAATTTGAA(SEQ ID NO.10)
[0061]Nd6 G13817：
[0062]左侧：AAAAATAAACCAATT(SEQ ID NO.11)
[0063]右侧：GCCCATGAGGAGTCA(SEQ ID NO.12)
[0064]Cytb G14365：
[0065]左侧：GCCGAGACGTAAACT(SEQ ID NO.13)
[0066]右侧：ATGGATGTGCGGT(SEQ ID NO.14)
[0067]Cox1 G5396：
[0068]左侧：CTACCTATTATTTGG(SEQ ID NO.15)
[0069]右侧：CATCCCTGTCGAAATTCA(SEQ ID NO.16)
[0070]Cox2 C7021：
[0071]左侧：ATATATCTTACATGGCTT(SEQ ID NO.17)
[0072]右侧：GAATGTTCTGCGGTGTAG(SEQ ID NO.18)
[0073]Cox3 G864：
[0074]左侧：ACCATATAGTAAACCCA(SEQ ID NO.19)
[0075]右侧：TTGTCCTCGGGATAG(SEQ ID NO.20)
[0076]Atp6 G8121：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大鼠mtDNA编码基因敲除方法，包括：选择大鼠mtDNA靠近基因编码框5
’
端的密码子TGA中碱基G或密码子CAA中碱基C作为目标靶点；在目标突变碱基G/C位置上下游分别选定一个TALE识别靶序列，两个TALE识别靶序列中间的间隔序列为7
‑
18bp，且不含除目标突变碱基G/C之外的碱基G/C，其中两个TALE识别靶序列与间隔序列一起限定目标突变序列；筛选能够准确靶向目标位点，并使其发生高效C
·
G
‑
to
‑
T
·
A转变的DdCBE组合，从而在大鼠mtDNA编码基因中引入终止密码子TAA，使得蛋白翻译提前终止。2.根据权利要求1的方法，其中实现大鼠mtDNA编码基因敲除的目标位点和DdCBE组合如下：Nd1 G2996：MTS
‑
N
‑
1366aa
‑
RVDarray
‑
C
‑
G1333C
‑
UGI+MTS
‑
N
‑
1366aa
‑
RVDarray
‑
C
‑
G1333N
‑
UGI(L1333C+R1333N)Nd2 G3992:L1333C+R1333NNd3 C9526:L1397C+R1397NNd4 G10230:L1333C+R1333NNd5 G11938:L1333C+R1333NNd6 G13817:L1333N+R1333CCytb G14365:L1333C+R1333NCox1 G5396:L1333C+R1333NCox2 C...

【专利技术属性】
技术研发人员：马元武，齐晓龙，张旭，董伟，孔维宁，张连峰，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：