一种检测单纯疱疹病毒II型的CDA引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测单纯疱疹病毒II型(HerpesSimplexVirusII，HSV2)的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对单纯疱疹病毒II型的保守区片段扩增的引物组，即HSV2

【技术实现步骤摘要】
一种检测单纯疱疹病毒II型的CDA引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测单纯疱疹病毒II型的CDA引物组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]单纯疱疹病毒II型(Herpes Simplex Virus II，HSV2)是一种双链DNA病毒，属于人疱疹病毒α亚科，单纯疱疹病毒属，根据抗原性的不同，分为2个亚型，即HSV1和HSV2型。其中，单纯疱疹病毒二型(HSV2)，主要引起生殖器部位皮肤黏膜及新生儿的感染，主要通过性接触和母婴垂直传播。单纯疱疹病毒具有嗜感觉神经节而形成潜伏感染状态的特性。本病多呈散发或原有潜伏病毒感染的反复发作。单纯疱疹病毒II型的经典检测方法为分离培养，经过2～3天培养后，观察细胞病变。而基于原位核酸杂交或PCR法检测标本中的HSV DNA，敏感性和特异性均高。但RT
‑
PCR方法需要在标准生化分析实验室，使用精密的实时荧光PCR仪，并需要试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的试验区，并不适用于现场快速筛查。此外，免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率高、灵敏度低，难于检测处于潜伏期的HSV2携带者，可能造成疫情的扩散。因此，快速、灵敏、高特异性核酸标志物现场检测技术的研发，将对由单纯疱疹病毒II型感染所导致的疾病提供快速有力的治疗手段。
[0003]基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification of nucleic acids，CDA)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法(中国专利号：ZL202110473121.8)，可替代日本LAMP核酸扩增方法。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。并且，CDA还可以缩短操作时间，提高检测效率，降低样品污染的机率，适用于单纯疱疹病毒II型的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP(40bp)短，这将节省检测成本。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是，提供一种检测单纯疱疹病毒II型的CDA引物组、试剂盒及其应用。
[0005]本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术通过对表1所述的4对引物组进行筛选，获得对单纯疱疹病毒II型检测效果最优的引物组为HSV2
‑
MF
‑
2/HSV2
‑
MR
‑
2。
[0007]表1
[0008]序列号引物名称核苷酸序列(5
’‑3’
)SEQ ID NO.1HSV2
‑
MF
‑
1ATCGGCCATCGCCAAATACGCCTTAGCAGACC
SEQ ID NO.2HSV2
‑
MR
‑
1CCCAATCGATGGCTCGGCTGAATGTGGTASEQ ID NO.3HSV2
‑
MF
‑
2CCCGCGAAATATACGCCTTAGCAGACCSEQ ID NO.4HSV2
‑
MR
‑
2AAGAACCTTCTGGTAAACACGCTTCACSEQ ID NO.5HSV2
‑
MF
‑
3GGCCATCTTAAAATACGCCTTAGCAGASEQ ID NO.6HSV2
‑
MR
‑
3GATCCCAATCATGTGGTAAACACGCTTSEQ ID NO.7HSV2
‑
MF
‑
4CTGGTCCAAACCAAATACGCCTTAGCASEQ ID NO.8HSV2
‑
MR
‑
4CTGACCGACCCTCGGCTGAATGTGGTA
[0009]本专利技术还提供一种检测单纯疱疹病毒II型的试剂盒，所述试剂盒包括CDA引物组HSV2
‑
MF
‑
2和HSV2
‑
MR
‑
2。
[0010]作为优选实施方案，所述CDA引物组中的引物HSV2
‑
MF和HSV2
‑
MR在反应体系中的浓度均为1～2μM。
[0011]作为优选实施方案，所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
[0012]作为优选实施方案，所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝或铬黑T。
[0013]作为优选实施方案，所述CDA反应缓冲液包括Tris
‑
HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X
‑
100。
[0014]作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：
[0015]2～50mM Tris
‑
HClpH8.8
[0016]2～20mM KCl
[0017]2～20mM(NH4)2SO4[0018]2～20mM MgSO4[0019]0.1～0.5％TritonX
‑
100
[0020]0.2～1M甜菜碱
[0021]1～1.6mM dNTP
[0022]5～10U Bst DNA聚合酶
[0023]100～150μmol/L显色剂
[0024]1～2μM引物HSV2
‑
MF
‑2[0025]1～2μM引物HSV2
‑
MR
‑2[0026]反应溶剂为超纯水。
[0027]本专利技术还提供该试剂盒用于非疾病诊断目的的检测单纯疱疹病毒II型的方法，包括以下步骤：
[0028]步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
[0029]步骤2，将步骤1所得扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有单纯疱疹病毒II型。
[0030]本专利技术还提供所述的CDA引物组在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒II型检测中的应用。
[0031]本专利技术还提供上述试剂盒在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒II型检测中的应用。
[0032]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0033]1，本专利技术提供的CDA引物组针对单纯疱疹病毒II型的特异保守区域Human alphaherpesvirus 2 strain MS,complete genome(GenBank:MK855052.1)，由2条引物组成，为序列内引物对(HSV2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断目的的检测单纯疱疹病毒II型的CDA引物组，其特征在于：所述引物组为HSV2
‑
MF
‑
2/HSV2
‑
MR
‑
2，其中HSV2
‑
MF
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，HSV2
‑
MR
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种检测单纯疱疹病毒II型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的CDA引物组。3.如权利要求2所述的一种检测单纯疱疹病毒II型的试剂盒，其特征在于：所述CDA引物组中的引物HSV2
‑
MF
‑
2和HSV2
‑
MR
‑
2在反应体系中的浓度均为1～2μM。4.如权利要求2所述的一种检测单纯疱疹病毒II型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水和显色剂。5.如权利要求4所述的一种检测单纯疱疹病毒II型的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。6.如权利要求4所述的一种检测单纯疱疹病毒II型的试剂盒，其特征在于：所述CDA反应缓冲液包括Tr...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛瑞，蔡挺，
申请(专利权)人：国科宁波生命与健康产业研究院，
类型：发明
国别省市：