一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒及其应用制造技术

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒及其应用；所述试剂盒包括EBV引物对，所述EBV引物对包括如SEQ ID NO.1所示的EBV正向引物和如SEQ ID NO.2所示的EBV反向引物；由于微滴数字PCR不需要扩增DNA，因此其检测的数据为DNA的绝对定量数值，相比RT

【技术实现步骤摘要】
一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒及其应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]EB病毒(EBV)是一种无处不在的γ型疱疹病毒，成人感染率超过90％，并且与多种淋巴细胞疾病和上皮细胞恶性肿瘤相关。在极少数情况下，EBV病毒感染后免疫反应失调可导致T和/或NK细胞的持续感染和EBV感染的反复激活，并引起非恶性以及恶性的EBV相关T/NK淋巴增殖性疾病(EBV
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T/NK
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LPDs)的发生。非恶性的EBV
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T/NK
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LPDs表现为从温和型到侵略型，主要包括皮肤或多系统T/NK细胞型慢性活动性EB病毒感染(CAEBV)，以及EBV相关的噬血细胞综合征(EBV HLH)。目前研究发现，血浆与外周血单个核细胞(PBMC)中EBV
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DNA拷贝数是衡量EBV在体内活动与潜伏的重要预后与治疗评判指标。
[0003]除了检测EBV病毒感染的PBMC和血浆，EBV病毒感染B、T、NK淋巴细胞也具有不同的临床表现、意义及临床预后。而在现阶段的临床环境中，由于EBV相关疾病进展迅速，故如何快速、准确进行EBV
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DNA拷贝数定量检测，是亟需解决的问题之一，对于临床患者具有重要意义。
[0004]目前商用的EBV
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DNA定量检测试剂盒，通过使用Real
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Time PCR法检测EBV稳定表达的基因片段(如EBNA
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1基因)来检测组织与血浆中EBV拷贝数大小；而除了EBNA
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1基因，BALF5基因、BamH1 W基因也因其高度保守的特性故常被用作EBV
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DNA的检测的目标基因。Real
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time PCR法简单、方便，目前运用广泛，但因需要经过DNA扩增步骤，再进一步通过内参基因作为参考，并建立标准曲线来衡量DNA数值，故非绝对定量检测，且此技术还存在仪器使用及精度要求高、难以制备标准品等难点。因此如何提供一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒，以实现对EBV的绝对定量检测。

技术实现思路

[0005]本申请提供了一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒及其应用，以解决现有技术中采用Real
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Time PCR法检测EBV过程中难以绝对定量检测的技术问题。
[0006]第一方面，本申请提供了一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括EBV引物对，所述EBV引物对包括如SEQ ID NO.1所示的EBV正向引物和如SEQ ID NO.2所示的EBV反向引物。
[0007]可选的，所述试剂盒还包括EBV探针，所述EBV探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]可选的，所述试剂盒还包括内参RPP30引物对和内参RPP30探针，所述内参RPP30引物对的上游引物如SEQ ID NO.4所示，所述内参RPP30引物对的下游引物如SEQ ID NO.5所示；和/或，
[0009]所述内参RPP30探针如SEQ ID NO.6所示。
[0010]可选的，所述试剂盒还包括PCR反应混合液和质控品溶液。
[0011]第二方面，本申请提供了一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒的应用，所述应用包括将第一方面所述的试剂盒用于检测EB病毒核酸拷贝数的方法中。
[0012]可选的，所述检测EB病毒核酸拷贝数的方法具体包括：
[0013]提取样本，并对所述样本进行前处理，得到淋巴细胞的DNA；
[0014]以所述淋巴细胞的DNA为样品，采用所述试剂盒配制微滴数字PCR的反应体系；
[0015]制备所述微滴数字PCR的反应体系的微滴；
[0016]对所述微滴进行微滴PCR反应，并对反应产物进行微滴分析，得到样本中EB病毒核酸拷贝数。
[0017]可选的，所述提取样本，并对所述样本进行前处理，得到淋巴细胞的DNA，具体包括：
[0018]采用含抗凝血剂提取离体的新鲜外周血样本，后进行梯度离心和磁性细胞分选，分别得到B淋巴细胞、T淋巴和NK细胞；
[0019]分别提取所述B淋巴细胞、所述T淋巴和所述NK细胞的DNA，得到淋巴细胞的DNA；
[0020]其中，所述抗凝血剂包括乙二胺四乙酸、草酸钠和枸橼酸钠中的至少一种。
[0021]可选的，所述微滴PCR反应的程序为：
[0022]95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火1min，45个循环；95℃酶失活10min；4℃液滴稳定30min。
[0023]可选的，所述微滴PCR反应中升温速度和降温速度分别≤2.5℃/s。
[0024]可选的，所述对所述微滴进行微滴PCR反应，并对反应产物进行微滴分析，得到样本中EB病毒核酸拷贝数，具体包括：
[0025]对所述微滴进行微滴PCR反应，得到反应产物；
[0026]对所述反应产物进行微滴分析，得到反应产物的有效液滴数；
[0027]根据所述有效液滴数和标准有效液滴数的大小，判断所述反应产物是否为有效产物；
[0028]若所述有效液滴数＞所述标准有效液滴数，则输出所述反应产物对应的拷贝数为EB病毒核酸拷贝数；
[0029]若所述有效液滴数≤所述标准有效液滴数，则排除掉所述反应产物；
[0030]其中，所述标准有效液滴数为1000。
[0031]本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0032]本申请实施例提供的一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒，由于微滴数字PCR不需要扩增DNA，因此其检测的数据为DNA的绝对定量数值，相比RT
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PCT具有更高的精度与准确度，而通过针对微滴数字PCR设计针对EBV的引物对，可以对含有EBV的微滴进行扩增，得到足够有效液滴数，从而能通过后续微滴分析过程中有效的剔除掉不符合预期的微滴，进而能提试剂盒检测的准确性，能通过试剂盒的阳性判断值直接判断样本的性质，从而可以对样本进行绝对定量检测。
附图说明
[0033]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施
例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
[0034]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0035]图1为本申请实施例提供的检测EB病毒核酸拷贝数的方法的流程示意图；
[0036]图2为本申请实施例提供的检测EB病毒核酸拷贝数的方法的详细流程示意图；
[0037]图3为本申请实施例提供的外周血样本前处理步骤和结果示意图，其中，图3A为外周血样本前处理步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括EBV引物对，所述EBV引物对包括如SEQ ID NO.1所示的EBV正向引物和如SEQ ID NO.2所示的EBV反向引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括EBV探针，所述EBV探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参RPP30引物对和内参RPP30探针，所述内参RPP30引物对的上游引物如SEQ ID NO.4所示，所述内参RPP30引物对的下游引物如SEQ ID NO.5所示；和/或，所述内参RPP30探针如SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应混合液和质控品溶液。5.一种检测EB病毒核酸拷贝数的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求1
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4任一项所述的试剂盒用于检测EB病毒核酸拷贝数的方法中。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测EB病毒核酸拷贝数的方法具体包括：提取样本，并对所述样本进行前处理，得到淋巴细胞的DNA；以所述淋巴细胞的DNA为样品，采用所述试剂盒配制微滴数字PCR的反应体系；制备所述微滴数字PCR的反应体系的微滴；对所述微滴进行微滴PCR反应，并对反应产物进行微滴分析，得到样本中EB病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖敏，汪佳晨，顾佳，张美兰，沈克锋，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：