本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，尤其是常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针、试剂及方法。本发明专利技术可以对牛病毒性腹泻BVDV病毒进行快速、实时、特异性检测，通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染，适合应用于多种荧光检测设备进行检测。适合应用于多种荧光检测设备进行检测。适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
【技术实现步骤摘要】
常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针、试剂及方法
[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其是常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针、试剂及方法。
技术介绍
[0002]牛病毒性腹泻(粘膜病)(Bovine viral diarrhoea/Mucosal disease)，二类传染病，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus简写BVDV属于黄病毒科瘟病毒属)引起的传染病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。
[0003]传染来源主要是病畜。病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。
[0004]主要在消化道和淋巴组织，口腔(口黏膜、齿龈、舌和硬腭)、咽部、鼻镜出现不规则烂斑、溃疡，以食道黏膜呈虫蚀样烂斑最具特征。流产胎儿的口腔、食道、真胃及气管内有出血斑及溃疡。运动失调的犊牛，严重的可见到小脑发育不全及两侧脑室积水。
[0005]目前牛病毒性腹泻BVDV病毒的诊断方法多为血清学方法和病毒分离鉴定，其灵敏度低，无法对早期感染进行确诊；而基于PCR的诊断方法耗时长，技术要求高，设备昂贵，无法普及。
[0006]综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
技术实现思路
[0007]针对上述的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针试剂及方法，其可以对牛病毒性腹泻BVDV病毒进行快速、实时、特异性检测，适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
[0008]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供常温等温扩增牛BVDV病毒的引物对和探针组合物，所述引物对包括核苷酸序列为TAAYRAGGGGGGTAGCARCAGTGGYGAGTTC(SEQ ID No:1)的上游引物和核苷酸序列为TGCCCTCGTCCACGTGGCATCTCGAGRCCT(SEQ IDNo:2)的下游引物；
[0010]所述探针的核苷酸序列为TGGATGGCTKAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTNGTCARTGGTTCGACRC(SEQ ID No:3)；
[0011]其中，斜体和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有荧光基团，碱基符号N为四氢呋喃，加粗和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有淬灭基团，斜体和下划线标识的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C上修饰有阻断基团。
[0012]在可选的实施方式中，所述荧光基团选自FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA或Cy5；所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
[0013]在可选的实施方式中，所述阻断基团选自胺基、磷酸基团、生物素或C3
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spacer。
[0014]第二方面，本专利技术提供常温等温扩增牛BVDV病毒的试剂，包括前述实施方式任一
项所述的引物对和探针组合物。
[0015]在可选的实施方式中，所述试剂还包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及核酸外切酶。
[0016]优选地，重组酶质量浓度为520～725ng/μL；单链DNA结合蛋白质量浓度为100～200ng/μL；DNA聚合酶质量浓度为350～450ng/μL；核酸外切酶质量浓度为300～400ng/μL。
[0017]在可选的实施方式中，所述试剂还包括聚乙二醇，Tris，乙酸钾，二硫苏糖醇，酸磷酸腺苷，磷酸肌酸二钠盐，磷酸肌酶，脱氧核糖核苷三磷酸，海藻糖和甘露醇。
[0018]优选地，聚乙二醇的体积分数占总试剂体积为2％～4％；Tris的摩尔浓度为20～40mM；乙酸钾的摩尔浓度为100～140mM；二硫苏糖醇的摩尔浓度为4～8mM；酸磷酸腺苷的摩尔浓度为2～4mM；磷酸肌酸二钠盐的摩尔浓度为40～60mM；磷酸肌酶的质量浓度为80～120ng/μL；脱氧核糖核苷三磷酸的摩尔浓度为250～300μM；海藻糖的质量体积比为5％～8％；甘露醇的质量浓度为20～40ng/μL。
[0019]在可选的实施方式中，部分试剂组分以冻干粉形式储存或运输，所述部分试剂组分包括，重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶、Tris、乙酸钾、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸和海藻糖和甘露醇。
[0020]优选地，所述部分试剂组分还包括辅助蛋白。
[0021]在可选的实施方式中，所述冻干粉的制备方法包括，将前述实施方式所述部分试剂组分混合得到的反应液在预冻得到预冻试剂，而后再经过梯度升温干燥得到冻干粉。
[0022]优选地，所述预冻的温度为
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80℃。
[0023]优选地，所述预冻的时间为1～1.5h。
[0024]优选地，所述梯度升温干燥包括两段干燥。
[0025]优选地，所述两段干燥中，第一段干燥温度为
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35～
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45℃，干燥时长为2～10h。
[0026]优选地，所述两段干燥中，第二段干燥温度为10～18℃，干燥时长为1～2h。
[0027]第三方面，本专利技术提供非诊断目的的常温等温扩增牛BVDV病毒的方法，所述方法包括对包括前述实施方式任一项所述试剂和待检样本的混合体系进行恒温孵育，而后通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测。
[0028]优选地，所述恒温孵育的温度范围为20℃～42℃。
[0029]优选地，所述恒温孵育的孵育时间为15～25min。
[0030]在可选的实施方式中，所述待检样本来源于牛的口鼻分泌物、牛肝脏、牛血液、牛的饮用水、饲养环境或上游饲料。
[0031]本专利技术提供的技术方案取得的技术效果为：
[0032](1)常温等温反应：与主要的几种核酸扩增技术相比，常温等温反应大大降低了对仪器加热模块的要求，也减少了对制冷模块的需求，因此使得反应仪器的选择面更加宽广。另外，对于配套检测仪器的设计可以趋于小型化、可携带化和操作简便化发展，而且对于检测操作的要求更加简单、便捷，因此可应用的区域和领域更加广阔。
[0033](2)反应快速：常温等温核酸扩增技术是利用多种工程酶在特定的溶液环境下，最大限度的模拟生物体内的核酸扩增反应，大大缩短了扩增过程所需的时间。相对于荧光定量PCR，扩增反应时间由1.5～2小时缩短至10～25分钟，明显提高了扩增效率。
[0034](3)实时检测：与淬灭基团分离的荧光基团和新合成的子链在数量上是一一对应
的，随着扩增反应的推进荧光信号是累积的。由于检测仪器采集荧光信号存在一定的时间间隔，因此随着时间的变化，检测的荧光信号是一个变化的过程，从而实现实时监测的效果。
[0035](4)定性与定量检测：通过采集的荧光信号绘制的扩增曲线可以用于对检测结果的判定。定性检测可以根据扩增曲线的线性快本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.常温等温扩增牛BVDV病毒的引物对和探针组合物，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列为TAAYRAGGGGGGTAGCARCAGTGGYGAGTTC的上游引物和核苷酸序列为TGCCCTCGTCCACGTGGCATCTCGAGRCCT的下游引物；所述探针的核苷酸序列为TGGATGGCTKAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTNGTCARTGGTTCGACR C；其中，斜体和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有荧光基团，碱基符号N为四氢呋喃，加粗和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有淬灭基团，斜体和下划线标识的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C上修饰有阻断基团。2.根据权利要求1所述的引物对和探针组合物，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA或Cy5；所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。3.根据权利要求1所述的引物对和探针组合物，其特征在于，所述阻断基团选自胺基、磷酸基团、生物素或C3
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spacer。4.常温等温扩增牛BVDV病毒的试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物对和探针组合物。5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及核酸外切酶；优选地，重组酶质量浓度为520～725ng/μL；单链DNA结合蛋白质量浓度为100～200ng/μL；DNA聚合酶质量浓度为350～450ng/μL；核酸外切酶质量浓度为300～400ng/μL。6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括聚乙二醇，Tris，乙酸钾，二硫苏糖醇，酸磷酸腺苷，磷酸肌酸二钠盐，磷酸肌酶，脱氧核糖核苷三磷酸，海藻糖和甘露醇；优选地，聚乙二醇的体积分数占总试剂体积为2％～4％；Tris的摩尔浓度为20～40mM；乙酸钾的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈新军，李喜平，何妍萍，罗虹，祁轩杰，张喜霞，石岩，
申请(专利权)人：甘肃康承利新生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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