用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针、试剂、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，涉及一种用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针、试剂、试剂盒及应用。本专利通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染，同时进行了利用了较轻便的荧光检测设备，实现了野外，塘边快读检测的效果，大大减少实验环节复杂性，并快速解决实验开展问题。并快速解决实验开展问题。并快速解决实验开展问题。

【技术实现步骤摘要】
用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针、试剂、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针、试剂、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）(Feline panleukopenia virus)隶属于弹状病毒科诺拉弹状病毒属，是传染性造血器官坏死病(Infectious Hematopoietic NecrosisIHN)的病原体。IHN是鲑鳟鱼类的一种严重的急性、传染性病毒病”根据鱼的种类、年龄、病毒株系以及环境条件的不同， IHN的爆发可能导致鱼体80%~100%的死亡率12对世界鲜鱼养殖业造成了重大损失。目前已成为制约鲑鱼养殖发展的重要威胁，由于其发病急、发病率高，已被国际兽医局OIF(Office International DesEpizooties)列为必须申报的疾病，被我国列为二类疫病。IHNV的生物学特性：IHNV粒子呈典型的弹状大小为(120~300)nmx(60~100)nm.有森膜不耐热、不耐酸对甘油、乙醚游离碘及氯仿敏感，在50%甘油中保存1~2周即失去活力问。IHNV能在许多鱼类细胞系中增殖，如大鳞大马哈鱼胚胎细胞系(CHSE
‑
214)、虹鳟性腺细胞系(RTG
‑
2)鲤鱼上皮瘤细胞系(EPC)胖头肌肉细胞系(FHM)蓝腮太阳鱼细胞系(BF
‑
2)等。生长温度为4~20℃，最适温度为15℃在23~25℃时病毒不复制。
[0003]IHNV主要存在于患病或无症状带病毒的野生及人工养殖的鱼体内。其传播途径有2种，水平传播和垂直传播，其中水平传播为其主要传播途径，水平传播主要感染源是苗种期间患过IHN残留下来的带病毒鱼病毒随着代谢产物排入水中，通过直接接触而感染，无脊椎动物也在水平传播中起到一定作用。
[0004]目前虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的诊断方法多为血清学方法和病毒分离鉴定，其灵敏度低，无法对早期感染进行确诊；而基于PCR的诊断方法耗时长，技术要求高，设备昂贵，无法普及。
[0005]综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针、试剂、试剂盒，其可以对虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）进行快速、实时、特异性检测，适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术首先提供了一种用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针，引物序列为：上游引物IHNV
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F1：ACCTTCGCAGAYCCCAACAACAAGCTTGCA；下游引物IHNV
‑
R1：CTGGTTGCAAGACGCTCGAGCTTGTTTTGG；探针序列为：IHNV
‑
Probe：AACGATCGKAAAGGAAAATGTCCTTGAGG/i6FAM
‑
dT/T/idSp//iBHQ1
‑
dT/
GACCGGCCTCCTCTT，其中，F为荧光基团， H为四氢呋喃，B为淬灭基团， 3
’
末端标记C3间臂。
[0008]本专利技术的特异性引物，是针对虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的设计的寡核苷酸。有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30
‑
35核苷酸（nt）之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。
[0009]荧光基团和粹灭基团之间相距2
‑
4nt，exo是一种核酸外切酶，能够识别THF位点，进行酶切反应，粹灭基团从荧光探针上脱落下来，荧光基团发射的荧光信号得以被检测出。本专利技术的特异性荧光探针，是针对虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）设计的寡核苷酸长链。寡核苷酸单链专一性识别虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）序列的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为46
‑
52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5
’
端的30
‑
35nt的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2
‑
4nt；3
’
末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、或C3
‑
spacer，用于抑制聚合酶从该位点开始延伸；探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素；荧光基团的种类较多，例如FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA或Cy5等，淬灭基团可选择BHQ1或BHQ2，以最大限度地降低背景荧光噪音为原则。
[0010]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针在虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测试剂或试剂盒中的应用。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述试剂包括聚乙二醇、Tris、乙酸钾、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸、海藻糖、甘露醇、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白及核酸外切酶。
[0012]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述试剂各组份的浓度范围如下：聚乙二醇，2
‑
4%；Tris，20
‑
40 mM；乙酸钾，100
‑
140 mM；二硫苏糖醇，4
‑
8 mM；酸磷酸腺苷，2
‑
4 mM；磷酸肌酸二钠盐，40
‑
60 mM；磷酸肌酶，80
‑
120 ng/
µ
l；脱氧核糖核苷三磷酸，250
‑
300
ꢀµ
M；海藻糖，5
‑
8%；甘露醇，20
‑
40 ng/
µ
l，重组酶520
‑
725 ng/
µ
l；单链DNA结合蛋白100
‑
200 ng/
µ
l；DNA聚合酶350
‑
450 ng/
µ
l；核酸外切酶300
‑
400 ng/
µ
l。
[0013]本专利技术试剂中的4种工程酶分别为重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及辅助蛋白核酸外切酶，是一系列具备特定功能的基因工程酶。它们具有以下特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针，其特征在于，引物序列为：上游引物IHNV
‑
F1：ACCTTCGCAGAYCCCAACAACAAGCTTGCA；下游引物IHNV
‑
R1：CTGGTTGCAAGACGCTCGAGCTTGTTTTGG；探针序列为：IHNV
‑
Probe：AACGATCGKAAAGGAAAATGTCCTTGAGG/i6FAM
‑
dT/T/idSp//iBHQ1
‑
dT/GACCGGCCTCCTCTT，其中，F为荧光基团， H为四氢呋喃，B为淬灭基团， 3
’
末端标记C3间臂。2.根据权利要求1所述用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测的引物和探针在虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测试剂或试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测试剂，其特征在于，所述试剂包括聚乙二醇、Tris、乙酸钾、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸、海藻糖、甘露醇、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白及核酸外切酶。4.根据权利要求3所述的用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒（IHNV）检测试剂，其特征在于，所述试剂各组份的浓度范围如下：聚乙二醇，2
‑
4%；Tris，20
‑
40 mM；乙酸钾，100
‑
140 mM；二硫苏糖醇，4
‑
8 mM；酸磷酸腺苷，2
‑
4 mM；磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：康鹏天，陈智，刘荭，高文慧，石岩，金静，王秀琴，金凡力，
申请(专利权)人：甘肃康承利新生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：