用于大规模人群中病毒病原体筛查的快速且样本特异性混合和检测方法技术

本申请涉及一种利用寡核苷酸杂交和目标特异性扩增反应对混合样品进行分析而不需要再次检测的方法。具体而言，本发明专利技术涉及用于大规模人群中病毒病原体筛查的快速且样本特异性混合和检测方法，涉及至少两个样本的样本混合和检测方法。更具体而言，核酸合成具有不同序列组成的一系列鉴定物寡核苷酸，使其与目标靶模板组合，其中每种鉴定物寡核苷酸对应于不同的样本。将上述产物混合在一起再对其进行扩增，并使用基于探针的杂交试验或尺寸分离模块来检测混合的样本，以鉴定样本混合池中的任意一个样本是否被检测为阳性，以及同时鉴定具体哪个样本是阳性的。哪个样本是阳性的。

【技术实现步骤摘要】
用于大规模人群中病毒病原体筛查的快速且样本特异性混合和检测方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2021年6月20日提交的美国临时申请系列号 No.63/212,719的优先权，其全部内容通过引用并入本文，包括所有表、图或附图。


[0003]本申请涉及医学检测领域。具体而言，涉及用于大规模人群中病毒病原体筛查的的快速且样本特异性混合和检测方法。

技术介绍

[0004]快速的宿主间传播和国际旅行的便利已经成为诸如H1N1、Zika、SARS以及最近的COVID
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19等流行病大规模流行的根本原因(参见文献“Broughton,J.P.；Deng,X.；Yu,G.；Fasching,C.L.；Servellita,V.； Singh,J.；Miao,X.；Streithorst,J.A.；Granados,A.； Sotomayor
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Gonzalez,A.；Zorn,K.；Gopez,A.；Hsu,E.；Gu,W.；Miller, S.；Pan,C.Y.；Guevara,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种至少两个样本的样本混合方法，该方法包括：a)将第一个样本与第一ID引物组合，并且将第二个样本与第二ID引物组合，其中：i)所述第一ID引物包含与靶核酸中的第一位点具有充分互补性的第一核酸序列区域，所述第一核酸序列区域有效连接至扩增区域和第一独特ID区域，和ii)所述第二ID引物包含与所述靶核酸中的所述第一位点具有充分互补性的第二核酸序列，所述第二核酸序列有效连接至扩增区域和第二独特ID区域；b)使所述第一ID引物和所述第二ID引物与所述第一个样本和所述第二个样本中的靶核酸序列杂交或连接，或者使用逆转录酶和所述第一ID引物或所述第二ID引物逆转录所述第一样本和所述第二样本中的所述靶核酸序列；c)用核酸外切酶消化未被使用的第一ID引物和第二ID引物；d)将所述第一个样本和所述第二个样本混合在一起；以及e)任选地，检测所述靶核酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶为缺乏RNase H活性的逆转录酶。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸外切酶为核酸外切酶I。4.根据权利要求1所述的方法，其中靶核酸序列为RNA或DNA。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一ID引物和所述第二ID引物的熔解温度相差约5℃至约15℃，或相差约10℃。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一ID引物和所述第二ID引物的长度彼此相差至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个核苷酸。7.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括使用实时聚合酶链式反应(RT
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PCR)。8.根据权利要求7所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括，向混合的样本中添加至少两种荧光团标记的探针(F探针)和至少一种淬灭剂标记的探针(Q探针)，所述至少两种荧光团标记的探针包括第一F探针和第二F探针，其中所述第一F探针的标记物包括荧光标记物，并且所述第一F探针与所述第一ID引物的所述第一独特ID区域互补，所述第二F探针包含荧光标记物并与所述第二ID引物的所述第二独特ID区域互补，并且所述Q探针包含淬灭剂标记物并与邻近所述靶核酸的所述第一位点的靶核酸区域互补。9.根据权利要求8所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括使用RT
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PCR，包括：i)向所述混合的样本中添加聚合酶和多种引物以提供反应混合物，所述多种引物包含正向引物和至少两种不同的反向引物；ii)如果所述反应混合物中存在所述靶核酸序列，则扩增所述靶核酸序列，以产生所述靶核酸序列的单链扩增子；iii)使所述至少两种F探针和所述Q探针与所述单链扩增子杂交，其中所述第一F探针和所述第二F探针的熔解温度均低于所述Q探针，并且所述Q探针具有淬灭剂标记物，当相应的F探针和Q探针与所述靶核酸的所述单链扩增子杂交时，所述淬灭剂标记物使相应的F探针的荧光淬灭；iv)升高所述反应混合物的温度，直至从单链扩增子释放出相应的F探针；以及v)检测释放出的F探针的荧光。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述反应混合物还包含至少一种或更多种试剂，
所述试剂选自由缓冲液、核苷酸、脱氧核苷酸和DNA聚合酶组成的组。11.根据权利要求8所述的方法，其中所述F探针的荧光标记物被标记在3'端。12.根据权利要求8所述的方法，其中所述Q探针的淬灭剂被标记在5'端。13.根据权利要求8所述的方法，其中所述Q探针的熔解温度为约70℃至约80℃。14.根据权利要求8所述的方法，其中所述Q探针具有3'反向扭转的dT。15.根据权利要求9所述的方法，其中第一反向引物与所述第一ID引物的所述扩增区域互补，并且第二反向引物与所述第二ID引物的所述扩增区域互补。16.根据权利要求9所述的方法，其中所述正向引物与所述靶核酸序列互补。17.根据权利要求7所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括向混合的样本中添加至少两种标记有荧光团和淬灭剂的探针，其中第一探针的标记物包括第一荧光标记物，并且该第一探针与所述第一ID引物的所述第一独特ID区域互补，并且第二探针的标记物包括第二荧光标记物，并且该第二探针与所述第二ID引物的所述第二独特ID区域互补。18.根据权利要求17所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括：i)向所述混合的样本中添加聚合酶、至少两种标记有荧光团和淬灭剂的探针、包含一种正向引物和至少两种不同的反向引物的多种引物，以提供反应混合物，其中第一反向引物与...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢怡铭，庄鑫宇，卢晓，李天从，
申请(专利权)人：香港科技大学，
类型：发明
国别省市：