一种用于早期预警新型冠状病毒中重型、危重型病例的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于早期预警新型冠状病毒中重型、危重型病例的试剂盒，以及试剂盒中所使用的特异性引物和探针。与现有技术相对比，本发明专利技术具有以下优点：本发明专利技术所提供的特异性引物、探针和试剂盒，其针对的miR

【技术实现步骤摘要】
一种用于早期预警新型冠状病毒中重型、危重型病例的试剂盒


[0001]本专利技术涉及医疗检测器械
，具体涉及一种用于早期预警新型冠状病毒中重型、危重型病例的试剂盒。
技术背景
[0002]新冠肺炎的特点之一是患者在感染病毒后表现出不同的症状，一部分患者症状轻微甚至无症状，而另一部分患者则会迅速出现急性呼吸窘迫综合征等重型/危重型症状，最终造成严重的脏器损伤甚至死亡。尽早对重症患者采取特殊监护和施加有效治疗手段（如肺保护性通气等），对于降低新冠肺炎的死亡率有重要意义。然而目前对于重症患者诊断的指标较为复杂繁琐，需要多项指标联合判断，这大大增加了医生负担，造成了较高的漏诊和误诊现象。另外，重症的发生仍缺乏可靠的预警标志物，难以在初始阶段对轻、重症患者进行区分，往往只能待患者出现重症症状后再进行治疗，从而错失了最佳的治疗时机。因此，筛选新冠感染者中的重症患者，提前进行干预和救治，对于减少新冠肺炎死亡率，合理分配医疗资源，有效控制疫情传播有重要意义。目前临床现有普遍应用的重型/危重型诊断方法，需要全套评估气促频率、指氧饱和度、动脉血氧分压/吸氧浓度、肺部影像学、呼吸衰竭、休克、器官衰竭等多个指标，操作较为繁琐，给医生临床诊断带来很大困难，容易造成重症患者出现漏诊和错诊。另一方面，目前临床上重型/危重型的早期预警指标，包括低氧血症、组织氧合指标、外周血淋巴细胞技术、炎症因子、D
‑
二聚体、胸部影像学等存在特异性和敏感性低的问题；难以在初始阶段对轻、重症患者进行区分，往往只能待患者出现重症症状后再进行治疗，从而错失了最佳的治疗时机。因此，为了更好的诊断和早期预警新冠感染重型/危重型患者，就迫切需要更好的生物标记物。
[0003]MicroRNA（miRNA）为一类长约19
‑
23个核苷酸的单链小核糖核酸（RNA）分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，通过抑制靶基因mRNA的翻译过程对基因表达进行调节，从而参与包括个体发育、组织分化、能量代谢等大部分生理活动，也与许多疾病的发生密切相关。2008年，本申请人研究团队首先发现人及动物血清/血浆中存在稳定的miRNA分子，且血清/血浆中存在的miRNA能够对抗强酸、强碱及核糖核酸酶的作用。后续申请人团队和国际上多个团队发现，血清/血浆中miRNA与肿瘤、自身免疫疾病、代谢性疾病等疾病的发生发展有极大的相关性，可作为这些疾病诊断的无创生物标志物。2015年，申请人团队开发了基于血清microRNA 技术的体外诊断试剂盒——胰安
TM
微小核糖核酸定性测试剂盒(荧光 PCR 法)是首个获得 CFDA 批准的 microRNA 产品，用于胰腺癌辅助诊断。
[0004]越来越多的研究发现病毒可以编码和表达miRNA，目前已有超过100种病毒来源的miRNA被鉴定出来；例如Zhang等人鉴定了HIV
‑
1病毒来源的miR
‑
H3
‑
3p，该miRNA具有增加HIV
‑
1的复制，减少病毒潜伏期的能力。随后研究发现，病毒感染人后其编码的miRNA可进一步分泌到血液中，通过检测血液中病毒来源的miRNA可用于病毒感染诊断和疾病监测等。例如，申请人团队与军事医学科学院团队合作，首次在埃博拉病毒感染患者的血清中检测到
了病毒来源的miRNA，该miRNA可在潜伏期提早诊断埃博拉病毒感染。2021年，南京大学研发团队曾联合其余三家单位在国际知名杂志Cell Discovery发表论文，报道了一项关于新冠重症检测的多中心联合研究，该研究中，研究人员首先在江苏地区收集的新冠患者血清中鉴定出了一种由新冠病毒编码的microRNA
‑
miR
‑
nsp3
‑
3p，miR
‑
nsp3
‑
3p是新冠病毒来源的核酸，它只存在于重症患者血清中，在轻症患者和健康人血清中均检测不到，提示了该标志物与新冠重症发生有关。进而，该团队在某某医院采集的血清样本中分别进行了独立验证，结果表明，血清miR
‑
nsp3
‑
3p在各个地区的样本中均能够准确区分轻、重症新冠患者，并且准确率显著高于D
‑
二聚体、C反应蛋白、低密度脂蛋白和淋巴细胞数等传统检验指标。更重要的是，通过对轻、重症患者不同病程阶段、不同时间点采集的血样进行检测分析发现，在重症患者出现重症症状之前约7.4天，就能够在患者血清中检测到miR
‑
nsp3
‑
3p，并且随着患者康复该标志物转为阴性，轻症患者检测结果则一直为阴性。数据表明，该标志物对重症的预测准确率高达97.1%，是一种精准预测患者发展为重症的预警标志物，并且具有病程监测价值。在临床治疗中，对该标志物进行监测，将有望帮助医生提前判断新冠患者病情走向，对于将要进入重症期的患者进行密切监控和提前治疗，从而降低患者死亡率。
[0005]此外，人自身内源性miRNA同样在新冠感染中发挥关键调控作用。2021年，南京大学研发团队联合某某单位在国际知名杂志Signal Transduction and Targeted Therapy发表论文，报道了一项关于新冠重症易感的机理研究。该研究中，研究人员首先通过高通量测序检测了年轻人（<30岁）和老年人（>60岁）miRNA图谱，筛选得到miR
‑7‑
5p、miR
‑
24
‑
3p、miR
‑
145
‑
5p和 miR
‑
223
‑
3p四个miRNA在高龄组显著降低，且生物信息学分析预测这四个miRNA可直接靶向抑制新冠病毒关键蛋白
‑
S蛋白（Spike Glycoprotein，通过与人细胞ACE2结合介导新冠病毒侵入细胞）的表达。利用荧光定量PCR的方法，申请人检测了来自某某医院共计35例健康年轻人（<30岁）、35例老年人（>60岁）和35例糖尿病患者的血清中这四个miRNA的表达水平，结果显示其中的三种miRNA（miR
‑7‑
5p、miR
‑
24
‑
3p和 miR
‑
223
‑
3p）在老年人和糖尿病患者中均显著减少；机制研究发现这三个miRNA可在细胞水平直接抑制S蛋白的表达；在活病毒试验中，这三个miRNA可直接抑制新冠病毒复制。上述研究结果说明这三种miRNA的减少是导致新冠重症主要因素之一，在血液中检测这三种miRNA可用于新冠感染患者中重症预警与诊断。
[0006]但在之前的研究中也发现，血清中除了miR
‑
nsp3
‑
3p之外，还含有的其它与轻重症新冠患者检测相关的miRNA，如miR
‑7‑
5p、miR
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测多种miRNA标志物的引物组，其特征在于，所述miRNA标志物为miR
‑
nsp3
‑
3p以及以下三种miRNA标志物中的至少一种：miR
‑7‑
5p、miR
‑
24
‑
3p和miR
‑
223
‑
3p，所述检测miRNA标志物的引物组中包括第一逆转录引物、第一PCR上游引物和第一PCR下游引物，第一逆转录引物序列如SEQ ID NO.1所示，第一PCR上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，第一PCR下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的检测多种miRNA标志物的引物组，其特征在于，所述检测miRNA标志物的引物组中还包括如下所述的至少一种引物组合；a)检测miRNA标志物的第二逆转录引物、第二PCR上游引物和第二PCR下游引物，第二逆转录引物序列如SEQ ID NO.5所示，第二PCR上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，第二PCR下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；b)检测miRNA标志物的第三逆转录引物、第三PCR上游引物和第三PCR下游引物，第三逆转录引物序列如SEQ ID NO.9所示，第三PCR上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，第三PCR下游引物序列如SEQ ID NO.11所示；c)检测miRNA标志物的第四逆转录引物、第四PCR上游引物和第四PCR下游引物，第四逆转录引物序列如SEQ ID NO.13所示，第四PCR上游引物序列如SEQ ID NO.14所示，第四PCR下游引物序列如SEQ ID NO.15所示。3.根据权利要求1或2所述的检测多种miRNA标志物的引物组，其特征在于，所述miRNA标志物为miR
‑
nsp3
‑
3p、miR
‑7‑
5p、miR
‑
24
‑
3p和miR
‑
223
‑
3p，所述引物组包括以下任意一种组合：1)检测miR
‑
nsp3
‑
3p的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物+检测miR
‑7‑
5p的第二逆转录引物、第二PCR上游引物、第二PCR下游引物；2)检测miR
‑
nsp3
‑
3p的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物+检测miR
‑
24
‑
3p的第三逆转录引物、第三PCR上游引物、第三PCR下游引物；3)检测miR
‑
nsp3
‑
3p的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物+检测miR
‑
223
‑
3p的第四逆转录引物、第四PCR上游引物、第四PCR下游引物；4)检测miR
‑
nsp3
‑
3p的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物+检测miR
‑7‑
5p的第二逆转录引物、第二PCR上游引物、第二PCR下游引物+检测miR
‑
24
‑
3p的第三逆转录引物、第三PCR上游引物、第三PCR下游引物；5)检测miR
‑
nsp3
‑
3p的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物+检测miR
‑7‑
5p的第二逆转录引物、第二PCR上游引物、第二PCR下游引物+检测miR

【专利技术属性】
技术研发人员：张辰宇，王延博，管丹萍，蒯健，
申请(专利权)人：江苏命码生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：