一种甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法技术

本发明专利技术提供了一种甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法：筛选感染单一SCSMV株系甘蔗材料，从中提取SCSMV病原液，制备待评价甘蔗种质无毒植株，将等量病原液分别接种至无毒幼嫩植株上，筛选出感染SCSMV的甘蔗植株，构建SCSMV荧光定量PCR标准曲线，对筛选出感染SCSMV的甘蔗植株进行荧光定量PCR检测，通过构建的标准曲线，精准测定不同甘蔗种质甘蔗叶片单位体积SCSMV积累量，形成对不同甘蔗种质对SCSMV的抗感差异精准比较分析。本发明专利技术方法能精准定量分析不同甘蔗种质病毒量含量差异，对感染SCSMV的甘蔗种质资源进行抗病性精准评价，为甘蔗抗病种质挖掘及通过关联分析挖掘甘蔗内源抗花叶病基因奠定基础。叶病基因奠定基础。叶病基因奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法


[0001]本专利技术属于植物保护领域，涉及一种用于抗病品种筛选及用于关联分析挖掘甘蔗抗SCSMV基因的甘蔗抗SCSMV精准评价方法。

技术介绍

[0002]甘蔗是世界上重要的经济作物，主要用于生产白糖及燃料乙醇。同其他作物一样，甘蔗的生产受到了一些生物及非生物的胁迫，降低了甘蔗的产量与品质。生物胁迫中细菌性病害、真菌性病害、病毒性病害及植原体病害占据甘蔗减产的20％以上。其中甘蔗病毒性病害可以显著的降低甘蔗产量及糖分，严重影响甘蔗产业的健康发展。甘蔗花叶病是甘蔗生产上发生的主要病毒性病害，是导致甘蔗产量和糖分降低的主要因素。引起甘蔗花叶病的几种病原如SCMV、SrMV和SCSMV均属于马铃薯Y病毒科病毒。在甘蔗种质资源中栽培种及野生种甘蔗花叶病的发生率几乎为100％，能使甘蔗的产量降低30
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80％。因而需要挖掘抗病基因及筛选抗病品种来防控这种化学防治难以奏效的病害。
[0003]病害调查表明甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)已超越甘蔗花叶病毒(SCMV)和高粱花叶病毒(SrMV)成为导致甘蔗产生花叶病的重要病原物，其发病时可以导致甘蔗叶片产生坏死病斑(图1)，严重影响甘蔗的株高(图2)及产量。甘蔗花叶病为非致死性病害，部分已感染SCSMV的甘蔗种质中较低的SCSMV载量可以实现较轻的花叶病症状，对植株的生长发育及产量的影响较低，是一种理想的抗病种质。SCSMV甘蔗体内复制、运输及积累需要与甘蔗内源基因进行互作来实现，通过抗病性精准评价及全基因组关联分析有望从该甘蔗种质资源中挖掘抑制SCSMV在甘蔗体内复制、运输及积累的相关基因。
[0004]建立甘蔗种质资源抗SCSMV精准评价方法是挖掘抗病品种及通过全基因组关联分析挖掘抗性相关基因的基础前提。传统的甘蔗抗花叶病评价方法主要是通过采集已感染的病叶通过磷酸缓冲液制作病原液并通过人工接种后肉眼观察症状统计发病率或通过田间调查统计自然发病率等进行评价。但是通过该方法很难实现精准评价的目的，比如对关联分析所需的300份以上的种质进行抗病评价时，存在制备的病原液在长时间的接种过程中前后病毒浓度不一致、摩擦接种的力度不一致、发病时间不一致、受环境影响极大肉眼难以完全准确判定花叶病症状等缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于规避了上述缺陷，通过对感染了SCSMV的甘蔗种质进行精准接种、精准采样及精准病毒载量检测实现了抗病性精准评价，适用于通过关联分析挖掘抗病甘蔗种质中抑制SCSMV在甘蔗体内复制、运输及积累的相关基因。
[0006]本专利技术的第一个方面是提供一种甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法，包括以下步骤：
[0007](1)筛选感染单一SCSMV株系甘蔗材料(作为甘蔗种质抗病性接种鉴定的病原来源)；
[0008](2)待评价甘蔗种质无毒植株制备：截取待评价的甘蔗种质植株顶端生长点处的幼叶组织为外植体，消毒后，通过愈伤诱导及脱分化培养获得组培苗，室温练苗后，温室培养，选取长势较一致的植株，通过病毒检测最终获得长势一致的甘蔗种质无毒幼嫩植株；
[0009](3)SCSMV病原液制备：从感染单一SCSMV株系甘蔗材料中提取获得SCSMV病原液；
[0010](4)甘蔗种质无毒植株SCSMV病原接种：将等量SCSMV病原液分别接种至步骤(2)获得的无毒幼嫩植株上；
[0011](5)筛选出感染SCSMV的甘蔗植株；
[0012](6)SCSMV荧光定量PCR标准曲线构建
[0013]对含SCSMV病毒的cDNA模板进行扩增，将PCR产物克隆至pMD19
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T载体，转化DH5α感受态细胞，构建重组质粒pMD19T
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SCSMV。提取pMD19T
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SCSMV质粒，测定浓度并计算其拷贝数；将梯度稀释的重组质粒标准品作为模板，进行实时荧光定量PCR反应，通过质粒模板不同浓度梯度的扩增曲线，得到扩增CT值与单位体积样品的病毒载量线性关系的标准曲线；
[0014](7)不同甘蔗种质SCSMV定量检测
[0015]采集步骤(5)筛选出感染SCSMV的甘蔗植株叶片组织，分别提取总RNA，逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，并通过构建的标准曲线，精准测定不同甘蔗种质甘蔗叶片单位体积SCSMV积累量，形成对不同甘蔗种质对SCSMV的抗感差异精准比较分析。
[0016]优选地，荧光定量PCR所用引物对为：SCSMV
‑
qF：CTCACGCCAAAGTAAGTCAA和SCSMV
‑
qR：TGCTGTTCGAGTTACGATTC。
[0017]优选地，标准曲线方程为y＝
‑
3.392
×
LOG(x)+40.19，其中，y为荧光定量PCR扩增的CT值，代表PCR扩增的循环数，单位cycles，LOG(x)为以10为底x的对数，x为质粒的拷贝数，单位copies。
[0018]优选地，步骤(1)为：采集花叶病症状明显的甘蔗植株叶片，提取叶片总RNA，通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定，筛选出只感染SCSMV的甘蔗植株。
[0019]更优选地，还对只感染SCSMV的甘蔗植株PCR检测产物进行高通量测序，确保无不同SCSMV株系混合感染的情况。
[0020]进一步优选地，用防虫网保护只感染SCSMV的甘蔗植株。
[0021]优选地，步骤(2)中通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定最终获得长势一致的甘蔗种质无毒幼嫩植株。
[0022]优选地，步骤(4)接种时采取对甘蔗最靠近芯叶能看见肥厚带的叶片(下文简称“+1叶片”)进行多个位点的擦伤接种。
[0023]更优选地，在病原液中加入等量石英砂，拇指和食指蘸取病原液，搓揉植株+1叶片基部至表皮擦伤，接种完后覆膜或套塑料袋保湿。
[0024]进一步优选地，间隔7天左右对新长出的完整的+1叶片进行擦伤接种，接种2
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4次。
[0025]采用本专利技术的上述方法对37种甘蔗种质进行精准评价，不同甘蔗种质对SCSMV的抗性大致如下文表4所示。
[0026]最优选地，所述精准评价方法包括以下步骤：
[0027](1)筛选感染单一SCSMV株系甘蔗材料
[0028]采集花叶病症状明显的甘蔗植株叶片，提取叶片总RNA，通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定，筛选出只感染SCSMV的甘蔗植株；优选地，还对只感染SCSMV的甘蔗植株PCR检测产物进行高通量测序，确保无不同SCSMV株系混合感染的情况；进一步优选地，用防虫网保护只感染SCSMV的甘蔗植株；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)筛选感染单一SCSMV株系甘蔗材料；(2)待评价甘蔗种质无毒植株制备：截取待评价的甘蔗种质植株顶端生长点处的幼叶组织为外植体，消毒后，通过愈伤诱导及脱分化培养获得组培苗，室温练苗后，温室培养，选取长势较一致的植株，通过病毒检测最终获得长势一致的甘蔗种质无毒幼嫩植株；(3)SCSMV病原液制备：从感染单一SCSMV株系甘蔗材料中提取获得SCSMV病原液；(4)甘蔗种质无毒植株SCSMV病原接种：将等量SCSMV病原液分别接种至步骤(2)获得的无毒幼嫩植株上；(5)筛选出感染SCSMV的甘蔗植株；(6)SCSMV荧光定量PCR标准曲线构建对含SCSMV病毒的cDNA模板进行扩增，将PCR产物克隆至pMD19
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T载体，转化DH5α感受态细胞，构建重组质粒pMD19T
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SCSMV。提取pMD19T
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SCSMV质粒，测定浓度并计算其拷贝数；将梯度稀释的重组质粒标准品作为模板，进行实时荧光定量PCR反应，通过质粒模板不同浓度梯度的扩增曲线，得到扩增CT值与单位体积样品的病毒载量线性关系的标准曲线；(7)不同甘蔗种质SCSMV定量检测采集步骤(5)筛选出感染SCSMV的甘蔗植株叶片组织，分别提取总RNA，逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，并通过构建的标准曲线，精准测定不同甘蔗种质甘蔗叶片单位体积SCSMV积累量，形成对不同甘蔗种质对SCSMV的抗感差异精准比较分析。2.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法，其特征在于，荧光定量PCR所用引物对为：SCSMV
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qF：CTCACGCCAAAGTAAGTCAA和SCSMV
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qR：TGCTGTTCGAGTTACGATTC。3.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法，其特征在于，标准曲线方程为y＝
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3.392
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LOG(x)+40.19，其中，y为荧光定量PCR扩增的CT值，代表PCR扩增的循环数，单位cycles，LOG(x)为以10为底x的对数，x为质粒的拷贝数，单位copies。4.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法，其特征在于，步骤(1)为：采集花叶病症状明显的甘蔗植株叶片，提取叶片总RNA，通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定，筛选出只感染SCSMV的甘蔗植株；优选地，还对只感染SCSMV的甘蔗植株PCR检测产物进行高通量测序，确保无不同SCSMV株系混合感染的情况；进一步优选地，用防虫网保护只感染SCSMV的甘蔗植株。5.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法，其特征在于，步骤(2)中通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定最终获得长势一致的甘蔗种质无毒幼嫩植株。6.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法，其特征在于，步骤(4)接种时采取对甘蔗最靠近芯叶能看见肥厚带的叶片进行多个位点的擦伤接种；优选地，在病原液中加入等量石英砂，拇指和食指蘸取病原液，搓揉植株最靠近芯叶能看见肥厚带的叶片基部至表皮擦伤，接种完后覆膜或套塑料袋保...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文治，冯小艳，张树珍，王俊刚，冯翠莲，赵婷婷，沈林波，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：