一种MP、Cpn和HRV核酸检测的试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种MP、Cpn和HRV核酸检测的试剂盒及使用方法，属于生物技术领域。检测试剂盒中的引物和探针组合包括分别用于肺炎支原体ATPase基因(DNA)、肺炎衣原体OmpA基因(DNA)和人鼻病毒5

【技术实现步骤摘要】
一种MP、Cpn和HRV核酸检测的试剂盒及使用方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种MP、Cpn和HRV核酸检测的试剂盒及使用方法，可用于肺炎支原体DNA、肺炎衣原体DNA和人鼻病毒RNA的同时检测。

技术介绍

[0002]肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)是介于细菌和病毒之间的病原微生物，通常可以引起呼吸系统感染性疾病，如发生咽痛、头痛、发热、乏力、肌肉酸痛等症状，是儿童和青少年临床常见呼吸道感染致病菌之一，它不仅可引起严重的肺炎，还可引起严重的并发症和持久的后遗症。
[0003]肺炎支原体(MP)的实验室检查方法通常包括：(1)血象检查：患者白细胞总数通常在正常范围内，只有少数患者白细胞有增高的迹象；(2)血清学检查：患者感染肺炎支原体后，会产生IgM抗体和IgG抗体，为了排除假阴性与假阳性，这两种抗体需要同时检测。另外，初次感染时呈阳性，再次感染时不一定呈阳性；(3)冷凝集试验：部分患者血清可以与红细胞有非特异性的凝集，又被称为冷凝集试验，此方法敏感性和特异性不理想；(4)培养法：临床中标本病原体含量少、需要时间长、阳性率低，支原体培养的营养成分高、生长缓慢，一般需要观察较长时间，对临床诊断帮助不大，目前应用较少；(5)核酸探针技术：该方法尽管也可以用于肺炎支原体的检测，但方法复杂，检测时间长，灵敏度低。
[0004]肺炎衣原体(Chlamydiapneumonia,Cpn)感染主要表现包括咽炎、喉炎、鼻窦炎、中耳炎、支气管炎及肺炎，以肺炎最常见，占50％以上，支气管炎次之。研究表明，肺炎衣原体不仅与呼吸道感染有关，而且与包括动脉粥样硬化、关节炎、哮喘、肺癌、慢性阻塞性肺疾病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症以及精神分裂症等多种疾病的发病机理均有关。
[0005]肺炎衣原体(Chlamydiapneumonia,Cpn)的实验室检查方法通常包括：(1)血象检查：外周血白细胞计数多正常，重症患者可升高，血沉常增快；(2)血清学检查：包括抗原和抗体检查，抗原检测有直接免疫荧光法、免疫荧光试验和酶联免疫吸附法(ELISA)，抗原检测有一定的敏感性和特异性，并且简便快速，但因与某些细菌有交叉反应，因而假阳性较高，特异性抗体可用补体结合法检测，但因产生的抗体滴度低，因而检测灵敏度较低；(3)病原学检查：包括直接涂片和培养法检査其特异性包涵体及原体，但时间长，阳性率低，目前已不常用；(4)原位杂交法检测：可鉴别衣原体的种、型，但操作烦琐。
[0006]人鼻病毒(Human Rhinovirus，HRV)是普通上呼吸道感染最主要的病原体，也是导致哮喘急性发作的常见病毒。在成人主要引起普通感冒等上呼吸道感染，在婴幼儿和慢性呼吸道疾病患者，除上呼吸道感染外，还能引起支气管炎和支气管肺炎。研究显示，成人约50％的感冒都是由人鼻病毒感染引起的，儿童感冒有10
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25％是由人鼻病毒致病，其中还有许多病例发展为哮喘。
[0007]人鼻病毒(Human Rhinovirus，HRV)的实验室检查方法通常包括：(1)血清学检测：包括补体结合试验、血凝抑制试验、间接免疫荧光及酶联免疫试验等，但由于缺乏合适的交叉反应抗原难以覆盖众多HRV血清型，使得这些方法的应用受到很大限制；(2)病毒培养：从
鼻咽分泌物及咽拭子中分离病毒，接种于细胞培养2
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3d后用中和抗体做中和试验和空斑形成试验，再进行特异的血清型鉴定。
[0008]综上所述，目前认为肺炎支原体、肺炎衣原体和人鼻病毒的检测方法，均存在灵敏度低、特异性差，耗时长，检查结果经常出现假阳性或假阴性等各种缺点，这些缺点导致了疾病的误诊、漏诊。
[0009]荧光PCR方法是指在反应体系中加入含荧光基因的探针，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，并在最后通过荧光信号对未知模板进行分析的方法。荧光PCR方法简便、快捷，具有良好的检测敏感性和特异性，并且可用于诊断、疗效判断及流行病学调查，是目前肺炎支原体、肺炎衣原体和人鼻病毒检测的主要方法。虽然荧光PCR方法是病原微生物检测的主要方法，但目前每次PCR过程普遍只能检测一种病原微生物，对于引起症状相似需要鉴别诊断的病原微生物来说，检测效率仍然相对较低，并且检测灵敏度也有很大的提高空间。

技术实现思路

[0010]为了实现在提升检测灵敏度和特异性的前提下提高检测效率、降低检测成本，同时提高临床鉴别诊断的能力的目的，本专利技术使用实时荧光PCR技术同时检测肺炎支原体DNA、肺炎衣原体DNA和人鼻病毒核酸RNA。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术根据病原体核酸的保守区域设计了分别针对肺炎支原体ATPase基因(DNA)、肺炎衣原体OmpA基因(DNA)和人鼻病毒5
’
UTR核酸(RNA)以及人Actin基因(DNA)的核酸检测试剂盒，其中包括如下引物和探针组合。
[0012]具体的，这些引物和探针组合的序列为：
[0013][0014][0015]其中，引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物分别是一组长为18
‑
23nt的碱基序列，Tm值在57
‑
64℃之间。
[0016]探针是一组5
’
端标记有FAM、VIC、ROX或Cy5的一种荧光基团的长度为24
‑
27nt的碱基序列。
[0017]并且，所有上下游引物以及探针序列的交叉二聚体(Cross Dimer)的ΔG小于5.1kcal/mol，优选的，ΔG小于4.5kcal/mol。
[0018]其中，人鼻病毒核酸RNA的下游引物“ACGCAAAGCCTAGTATCA”同时也是逆转录引物。
[0019]在配制过程中，所述上游引物按0.1
‑
0.5μM的浓度等比例混合。优选的，所述上游引物的浓度为0.15μM。
[0020]所述下游引物按0.1
‑
0.5μM的浓度等比例混合。优选的，所述下游引物的浓度为0.15μM。
[0021]所述探针按0.1
‑
0.5μM的浓度非等比例混合。优选的，所述探针浓度分别为FAM标记的探针浓度为0.1μM、VIC标记的探针浓度为0.1μM、ROX标记的探针浓度为0.2μM和Cy5标记的探针浓度为0.1μM。
[0022]使用实时荧光PCR技术同时检测多种病原体核酸，除了每种病原体的引物探针要符合序列保守、G+C含量和Tm值适中、引物探针之间交叉二聚体要少等这些引物探针设计基本原则之外，还要保证所有的引物探针之间无干扰，因为出现干扰会导致PCR反应曲线不呈“S”形、扩增效率低Ct延后、荧光强度低下以及非特异性扩增等问题，直接影响检测的灵敏度和特异性。因此，为了保证检测灵敏度和特异性，本专利技术设计联合诊断肺炎支原体、肺炎衣原体以及人鼻病毒的引物探针的原则为：1、无论是引物之间、引物与探针还是探针之间，均不能出现连续6个碱基完全配对；2、无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MP、Cpn和HRV核酸检测的试剂盒，用于肺炎支原体ATPase基因DNA、肺炎衣原体OmpA基因DNA和人鼻病毒5
’
UTR RNA的同时检测，其特征在于：包括如下引物和探针的组合，所述引物和探针组合的序列为：2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括用于内标的人Actin基因检测的引物和探针，且所述用于内标的人Actin基因检测的引物的探针的序列分别为：人Actin基因上游引物序列：5
’‑
GATCCCAGAGGTGCATTA
‑3’
；人Actin基因下游引物序列：5
’‑
AGTCCTCCAGATCCTTTG
‑3’
；人Actin基因探针序列：5
’‑
Cy5
‑
CAAGCCAGTTACCATGAGGAATCC
‑3’
。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR增强剂，所述PCR增强剂包括硫酸铵、β
‑
环糊精、Tween20和BSA中的一种或多种的混合物。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括防污染酶混合液，所述防污染酶混合液包括dUTP、UNG酶、Hotstar DNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂中的一种或多种的混合物。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括含有肺炎支原体ATPase基因片段的载体、含有肺炎衣原体OmpA基因片段的载体、含有人鼻病毒5
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UTR核酸片段的病毒样颗粒、以及TE Buffer；所述阴性对照为氯化钠溶液。6.一种如权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)核酸提取：对样本进行核酸提取；(2)预处理：取出检测试剂盒内的试剂，进行离心处理；(3)配制PCR反应体系：配制PCR反应体系并分配...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄学文，唐磊，
申请(专利权)人：苏州康唯纳思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：