一种液基细胞保存液及其配制方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种液基细胞保存液及其配制方法和应用，属于生物提取技术领域，液基细胞保存液包括pH缓冲液、渗透压维持剂、固定剂、抑菌剂、粘液消化剂、核酸保护剂及红细胞溶解剂；配制时，首先将渗透压维持剂、核酸保护剂、粘液消化剂加入pH缓冲液中，混合均匀后，再加入固定剂、抑菌剂和红细胞溶解剂。本发明专利技术的液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞时，可长时间保存细胞，确保细胞形态完整，并且能够保护核酸，提高TCT检查的阳性率；同时本发明专利技术的液基细胞保存液的原料和加工配制成本低、易于推广，可替代进口产品。可替代进口产品。可替代进口产品。

【技术实现步骤摘要】
一种液基细胞保存液及其配制方法和应用


[0001]本专利技术属于生物提取
，具体涉及一种液基细胞保存液及其配制方法和应用。

技术介绍

[0002]作为宫颈病变的筛查方法，传统的巴氏涂片涉及到的取材、涂片质量、细胞分离等诸多过程都会严重降低细胞的阳性率。液基薄层细胞学检测技术（TCT）改变了以往巴氏涂片的操作方法，它将采集到的细胞几乎全部保存到保存液里，同时处理掉杂质，制出背景干净清晰、细胞重叠少、无退变或退变轻微的薄层细胞涂片。采用液基薄层细胞学检测技术对异常细胞的诊断正确率提高了13%，对鳞状上皮以上病变的检出率提高了65%，具有传统涂片无法比拟的优点。
[0003]TCT技术已成为宫颈癌筛检的最好方法之一，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供了非常明确的诊断依据。TCT技术中最为关键的环节为液基细胞保存液，因此开发出合适的宫颈脱落细胞保存液尤为重要。目前，市场上出现了专门用于脱落细胞保存的溶液，如美国FDA1996年批准的新柏氏（ThinPrep Cytology Test）和1999年批准的Autocyte Prep（现称为SurePath，TripPath Imaging，Burlington，NC，现属于BD诊断公司），但是这些液基细胞保存液几乎无一例外存在：1、成本昂贵；2、宫颈粘液分解不充分，导致细胞重叠较多；3、不能溶解血细胞处理，同时有引起细胞核缩小的现象；4、细胞保存时间短；5、细胞的核酸容易降解等问题，这些缺点严重影响了TCT技术的应用和推广。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决上述TCT技术中的不足，提供一种细胞形态和核酸保存时间长、血细胞和黏液处理效果好，并且性价比更高的液基细胞保存液。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术公开了一种液基细胞保存液，又称为脱落细胞保存液，包括pH缓冲液、渗透压维持剂、固定剂、抑菌剂、粘液消化剂、核酸保护剂及红细胞溶解剂；固定剂用于维持细胞的形态。
[0006]其中，pH缓冲液为MES（4
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吗啉乙磺酸）、Bis
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Tris（双(2
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羟甲基)氨基
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三(羟甲基)甲烷）、MOPS（3
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吗啉丙磺酸）、PIPES（1,4
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哌嗪二乙磺酸）中的一种或多种的混合物；优选的，pH缓冲液为浓度为10
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50mmol/L的PIPES缓冲液；其中，渗透压维持剂为氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠及葡萄糖等中的一种或多种的混合物；优选的，渗透压维持剂为质量百分数为4.4
‑
5.5%的葡萄糖溶液。
[0007]其中，固定剂为无水乙醇、甲醇及多聚甲醛中的一种或多种的混合物；优选的，固定剂为体积百分数为45
‑
65%的甲醇。
[0008]其中，抑菌剂为Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300及Proclin 5000中的一种或多种的混合物；优选的，抑菌剂为体积百分数为0.01%
‑
0.05%的Proclin300。
[0009]其中，粘液消化剂为DTT（二硫苏糖醇）、EDTA（乙二胺四乙酸二纳）、TCEP中的一种
或多种；优选的，粘液消化剂为质量百分数为0.1%
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0.5%的DTT和质量百分数为0.1%
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0.5%的EDTA 的组合。
[0010]其中，核酸保护剂为焦磷酸二乙酯、氧钒核糖核苷复合物、RNA酶抑制剂（RNasin）、尿素、SDS、TCEP中的一种或多种；优选的，所述的核酸保护剂为0.1
‑
10mmol/L的TCEP。
[0011]其中，红细胞溶解剂为Triton X
‑
100、NP40及Tween 20中的一种或多种的混合物；优选的，红细胞溶解剂为体积百分数为0.01%
‑
0.5%的Triton X
‑
100。
[0012]本专利技术中，PIPES（哌嗪
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1,4
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二乙磺酸）的pKa接近生理pH值，因此PIPES非常适合用于生物pH缓冲液，如细胞培养等。
[0013]葡萄糖不能自由通过细胞膜，5%葡萄糖的渗透压为278mmol/L，人体的等渗环境为280
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320mmol/L，两者相差不大，因此以5%左右的葡萄糖作为渗透压维持剂，能够维持环境渗透压和细胞形态稳定。
[0014]醇或醛作为固定剂，具有固定细胞的作用，其中甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态并保持细胞的活性，甲醇还可以提高细胞对染料的吸收作用，有利于后续的细胞染色。
[0015]Proclin系列的抑菌剂还具有防腐功能，与细胞接触几分钟后，即可渗透到细胞膜内并抑制微生物KREBS循环的核心酶，从而引起微生物内能量水平迅速下降，导致微生物能量代谢崩溃，其中Proclin300对下游的诊断用酶和抗体（比如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、IgM等）活性无影响，并且对人畜无害，因此Proclin300是理想的液基细胞保存液的抑菌剂。
[0016]宫颈粘液的主要成分为粘蛋白，而粘蛋白的粘性主要由分子间二硫键和一些金属离子维持，TCEP和DTT能够破坏粘蛋白的分子间二硫键和细胞间连丝，从而达到消化粘液的目的。而EDTA能够螯合金属离子，从而破坏细胞间的连接，也在一定程度上协助消化粘液。细胞离体后，核酸酶包括DNase和RNase很快就会发生作用导致核酸降解，而核酸酶的活性中心需要二硫键来维持，当二硫键处于还原状态下时，核酸酶将失去作用。TCEP和DTT是一种还原剂，能将
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SH基保持在还原态，常用于还原蛋白和多肽中的二硫键。TCEP还原能力很强，在pH2.5
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11的范围均具有很好的稳定性，并且TCEP的刺激性和毒性都处于安全水平。虽然TCEP是理想的核酸保护剂和粘液消化剂，但是浓度太高容易导致细胞形态变化。综上所述，TCEP和DTT具有相似的作用，为了达到消化粘液、抑制核酸酶同时保持细胞形态的目的，本专利技术选择DTT、EDTA和TCEP组合，这样一方面可以降低TCEP的使用浓度以保持细胞形态，另一方面可以充分消化粘液同时保护核酸不被降解。
[0017]非离子表面活性剂如Triton X
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100、NP40和Tween 20都是比较温和的去垢剂，其中Triton X
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100一方面可以提高真核细胞的通透性但不破坏核膜，从而使上皮细胞的核在上述5%葡萄糖形成的等渗环境中更加稳定；另一方面具有裂解细胞的作用，在0.1%的浓度时即可迅速溶解红细胞。在这两方面作用下，从而达到溶解血细胞的同时有效保护细胞核的形态。
[0018]本专利技术同时还要求保护一种上述液基细胞保存液的配制方法，包括如下步骤：（1）配制pH缓冲液，备用；（2）在pH缓冲液中，加入配方量的渗透压维持剂、核酸保护剂、粘液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液基细胞保存液，其特征在于：包括pH缓冲液、渗透压维持剂、固定剂、抑菌剂、粘液消化剂、核酸保护剂及红细胞溶解剂。2.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述pH缓冲液为MES、Bis
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Tris、MOPS、PIPES中的一种或多种的混合物。3.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述渗透压维持剂为氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、葡萄糖等溶液中的一种或多种的混合物。4.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述固定剂为无水乙醇、甲醇、多聚甲醛中的一种或多种的混合物。5.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述抑菌剂为Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300、Proclin 5000中的一种或多种的混合物。6.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述粘液消化剂为DTT、EDTA、TCEP中的一种或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄学文，唐磊，
申请(专利权)人：苏州康唯纳思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：