一种引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用，属于生物技术领域，引物和探针的组合中，引物包括上游引物、下游引物和内标基因的引物，探针包括31条特异性探针和内标基因的探针；上游引物与GP5+同源，下游引物与GP6+同源；上游引物的序列，以及下游引物的序列，各自分别与至少一个HPV型别中的基因序列有≦3个碱基的差异；内标基因为人类管家基因β

【技术实现步骤摘要】
一种引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用。

技术介绍

[0002]HPV病毒(宫颈人乳头瘤病毒)是一种亲上皮细胞的双链DNA病毒，其基因组长7900bp，目前已发现有约200多型HPV病毒，该病毒主要感染皮肤和粘膜的上皮细胞，造成上皮增生甚至恶性转化。人们已经在生殖道检测到超过40型的HPV，其中，经WHO国际癌症研究机构(IARC)确认的有31种HPV的基因型，包括13种高危亚型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，这部分型别的HPV病毒与宫颈内皮增生及宫颈癌密切相关；还有13种低危亚型，例如：6、11、40、42、43、44、55、61、67、69、70、72和81，这部分型别的HPV病毒主要存在于良性病变中，多造成生殖道疣等疾病，因此被称为低危型；以及5种中等风险的亚型，例如：26、53、66、73和82等。但是，在实际中人为区分的高危型或低危型并不是绝对的，因为在一些癌变中确实也存在上述的低危型HPV病毒。
[0003]多数HPV病毒对人体的感染都是一过性的，病毒很快会被人体免疫系统清楚，但少数情况下，病毒整合入宿主基因组DNA，转变为持续感染，从而引发宫颈恶性病变。研究表明，接近100％的宫颈癌样本中都可以检测到HPV病毒。据统计，每年约有29万人死于宫颈癌，同时，每年还有大约49万例新发宫颈癌病例。因此，对HPV病毒有效的检测方法，具有重要的临床和社会意义。
[0004]目前，HPV病毒尚不能人工体外培养，并且HPV的血清学检测技术也不成熟，对HPV病毒感染的检测方法仍然局限于使用分子生物学的方法在待测样本中直接检测，例如：原位杂交、液相杂交(杂交捕获技术)等，但是这些方法不但操作复杂，而且敏感性有限。
[0005]而HPV病毒的PCR检测具有操作简单、高敏感性等优点，对待测样本进行PCR检测仍是目前实验室最常用的一种检测方法。但是HPV病毒存在很多的型别，对每一型都使用其特异引物进行PCR检测的工作量十分巨大；同时，序列特异的PCR只能扩增序列已知的HPV病毒，对于未知HPV型或存在变异的HPV则不能进行有效的扩增检测。因此，在测试中，人们通常会选取HPV病毒基因组序列中较为保守的L1和E1基因区域设计通用引物，以实现在单一PCR反应中同时检测多种型别HPV的目的。目前常用的通用引物根据设计原则的不同分为三类：第一，单一引物，例如：GP5+/GP6+；第二，简并引物，例如：MY09/MY11；第三，混合引物，例如：SPF1/SPF2。上述三类针对HPV病毒的L1基因序列的通用引物可以有效地扩增现在已知的大部分HPV病毒，尤其是感染生殖道的HPV病毒类型，同时，这些通用引物还可以发现新的病毒型、亚型及病毒变异体，因此这三类通用引物被广泛应用于大样本流行病调查中。
[0006]虽然上述三类通用引物在实际应用中非常成功，但是作为通用引物，其缺点也是很明显的。具体的，对于第一类通用引物，GP5+/GP6+仅与某个或少数个HPV型别的序列匹配，而对与多数型别的HPV，引物结合区都存在或多或少的碱基错配。由于错配序列的存在，引物与模板的结合势必会受到影响，这将大大降低PCR扩增的效率，这也使得该类通用引物
对不同型别的HPV扩增效率不同，对于某些与引物匹配较差的HPV型别，其感染情况往往可能被低估。实际应用中，该类通用引物对HPV52这种常见的宫颈高危HPV扩增效率较低。对于第二类通用引物，MY09/MY11在合成时，需要在引物序列的特定位点随机插入两到三种不同的碱基，这一不可控的过程导致人们无法保证在混合引物中每一种特定的引物序列都能够以相同的几率出现。因此，不同批次合成的MY09/MY11实际存在差异，而这种差异也往往导致不同批次合成的引物对相同样本中病毒的扩增也会出现效率不同的问题。这种缺点对于需要扩增条件稳定、实验结果均一的大样本病毒感染率检测是十分不利的。
[0007]除了上述缺点之外，当同一个样本中同时存在多种HPV类型感染时，通用引物扩增往往还存在竞争抑制，这使多重感染很难正确检测，特别是存在较多碱基错配的HPV及感染量很低的样本，就很难被检测到。
[0008]针对通用引物的这些缺点，研究人员尝试了多种解决方案，例如将SPF1和GP6+配合使用、改造MY09/MY11简并引物，使其成为类似SPF1/SPF2的混合引物，比如PGMY09/PGMY11通用引物等。但是至今为止，通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同，对某些型别的HPV扩增效率低这些缺点仍然没有很好的解决办法。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于实现在单一PCR反应中同时检测多种型别HPV，并且保证不同型别的HPV扩增效率基本一致，以及各种型别的HPV感染都能得到正确评估。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术设计了一组引物和探针的组合，其中引物包括一组上游引物和一组下游引物，以及内标基因的引物；探针包括31条特异性探针和内标基因的探针；
[0011]其中上游引物与GP5+同源，且与GP5+的序列相似；下游引物与GP6+同源，且与GP6+的序列相似。
[0012]其中，上游引物是一组长为23nt的与GP5+同源的碱基序列，T
m
＝50
‑
60℃；
[0013]其中上游引物选自下述6条基于GP5+的引物中的任意5条的组合，所述6条基于GP5+的引物的序列分别为：
[0014]F1：TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC；
[0015]F2：TTTGTTACTGTTGTGGATACCAC；
[0016]F3：TTTGTTACTTGTGTTGATACTAC；
[0017]F4：TTTCTTACTGTAGTGGACACTAC；
[0018]F5：TTTTTAACAGTTGTAGATACTAC；
[0019]F6：TTTGTAACAGTTGTAGATACCAC；
[0020]优选的，上游引物由F1、F2、F3、F4和F5组合而成；优选的，各个序列的浓度相等，且等量混合，所述浓度的范围为0.1
‑
0.5μM；优选的，浓度选择0.2μM。
[0021]其中，下游引物是一组长为25nt的与GP6+同源的碱基序列，T
m
＝45
‑
55℃；
[0022]其中下游引物选自下述8条基于GP6+的引物中的任意6条的组合，所述8条基于GP5+的引物的序列分别为：
[0023]R1：GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC；
[0024]R2：GAGTATGAATTACAATTTATGTTTC；
[0025]R3：GAATTTGATTTACAGTTTATTTTTC；
[0026]R4：GAATATGAATTACAGTTTGTGTTTC；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物和探针的组合，其特征在于：所述引物包括上游引物、下游引物和内标基因的引物，所述探针包括31条特异性探针和内标基因的探针；所述上游引物与GP5+同源，所述下游引物与GP6+同源；所述上游引物的序列与至少一个HPV型别中的基因序列有≦3个碱基的差异；所述下游引物的序列与至少一个HPV型别中的基因序列有≦3个碱基的差异；所述内标基因为人类管家基因β
‑
globin。2.如权利要求1所述的引物和探针的组合，其特征在于：所述上游引物选自下述6条引物中的任意5条的组合，所述6条引物的序列分别为：F1：TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC；F2：TTTGTTACTGTTGTGGATACCAC；F3：TTTGTTACTTGTGTTGATACTAC；F4：TTTCTTACTGTAGTGGACACTAC；F5：TTTTTAACAGTTGTAGATACTAC；F6：TTTGTAACAGTTGTAGATACCAC。3.如权利要求2所述的引物和探针的组合，其特征在于：所述上游引物由F1、F2、F3、F4和F5组合而成。4.如权利要求3所述的引物和探针的组合，其特征在于：所述上游引物中的F1、F2、F3、F4和F5的浓度相等，且等量混合，所述浓度的范围为0.1
‑
0.5μM。5.如权利要求1所述的引物和探针的组合，其特征在于：所述下游引物选自下述8条引物中的任意6条的组合，所述8条引物的序列分别为：R1：GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC；...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄学文，唐磊，
申请(专利权)人：苏州康唯纳思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：