一种RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品及其制备方法，属于重组质粒标准品量化定标方法领域。本发明专利技术通过从新冠病毒序列中筛选出保守和特异的RdRp基因序列，经人工合成后再由T4 DNA连接酶将其连接在pUC57载体上，通过大肠杆菌扩增，纯化检测后作为质粒标准品。本发明专利技术构建的RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品，可以作为新型冠状病毒商品化检测试剂盒中的阳性对照，避免了直接使用病毒样本作为阳性对照带来的生物安全风险；还可将该质粒标准品作梯度浓度稀释后，建立标准曲线以便进行病毒拷贝数绝对定量(102‑

【技术实现步骤摘要】
一种RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品及其制备方法


[0001]本专利技术属于重组质粒标准品量化定标方法领域，更具体地说，涉及一种RPA 检测新型冠状病毒的质粒标准品及其制备方法。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)是一种线性单股正链RNA病毒，为β属冠 状病毒，直径约60
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140nm，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，能够 引起呼吸道、肠道等疾病。其传播速度之快，较短时间内便引起全球疫情危机。 SARS
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CoV
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2基因组序列测序结果显示基因组含12个开放读码框(ORF)，其 中ORF1ab为RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因所在区域，编码RNA聚 合酶，负责病毒核酸复制。从进化树上可以看出SARS
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CoV
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2的RdRp基因与 SARS
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CoV的RdRp基因显著不同，因此RdRp基因成为鉴定SARS
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CoV
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2核酸 的一个重要标志物，也是目前所有新冠病毒核酸检测试剂的靶基因之一。
[0003]目前，核酸检测是新冠病毒检测的重要方法之一。国家药品管理监督局已 批准的SARS
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CoV
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2核酸检测试剂都是基于传统的实时荧光定量PCR(RT
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PCR) 方法，目前上市的新冠病毒RT
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PCR检测试剂盒检测下限基本在每微升500到 1000拷贝，且样本检测耗时长达2
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3小时，检测周期较长存在一定的局限性。 在实践中，该方法存在同一实验室复检结果不一致的现象，此外各个检测机构 对新冠病毒的检测水平参差不平，导致不同实验室之间监测水平存在差异，严 重影响了数据的准确性。而重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种快速检测核 酸的技术，与RT
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PCR技术相比，该技术反应温度恒温(一般在37～42℃)，反 应快速，在20min内即可获得可检出的扩增产物。
[0004]使用RPA方法检测检测SARS
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CoV
‑
2，为确保结果的准确性，需对检测结 果进行定量分析。与相对定量相比，绝对定量分析需要使用已知拷贝数的绝对 标准品，并做标准曲线，用于确定样本中核酸的绝对量值，即通常所说的拷贝 数。为了使日后RPA检测方法操作更加便捷、拥有阳性对照品以及实现对病毒 的绝对定量等，需要构建SARS
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CoV
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2标准品质粒。因质粒标准品的制备和测 定其DNA含量比较困难，故在RPA检测方法建立的过程中标准品质粒的构建 是绝对定量检测的关键因素之一。据现有文献，基于RPA技术的新型冠状病毒 质粒标准品的制备尚未有研究报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提出一种 基于RPA技术检测新型冠状病毒的质粒标准品。本专利技术所要解决的另一技术问 题在于提供前述新型冠状病毒的质粒标准品的制备方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品，含有新冠病毒的RdRp基因序 列，所述的RdRp基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选地，所述的质粒标准品使用的载体是pUC57。
[0009]所述的RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品在新冠病毒检测试剂盒中作为 阳性对照品的应用。
[0010]所述的RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品在定量检测新冠病毒中的应用。
[0011]一种制备权利要求1所述RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品的方法，其 包括如下步骤：
[0012]1)人工合成如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0013]2)将步骤1)所述的核苷酸序列连接到载体上；
[0014]3)扩增步骤2)所得载体，即得所述的RPA检测新型冠状病毒的质粒标准 品。
[0015]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0016]本专利技术提供一种基于RPA技术检测新型冠状病毒的质粒标准品及其制备方 法，解决了目前RPA检测新型冠状病毒的方法无阳性对照且不能绝对定量等不 足等问题：一方面可以作为新型冠状病毒商品化检测试剂盒中的阳性对照，避 免了直接使用病毒样本作为阳性对照带来的生物安全风险；另一方面，将质粒 标准品作梯度浓度稀释后，可建立标准曲线以便进行病毒拷贝数绝对定量(102ꢀ‑
105copies)，简单易行、重复性好，应用前景广阔。
附图说明
[0017]图1是本专利技术的质粒载体图；
[0018]图2重组质粒转化大肠杆菌DH5a菌落克隆图(A、B为阴性，C、D为阳 性)；
[0019]图3是质粒DNA进行酶切和部分测序鉴定结果图；
[0020]图4是RdRp基因序列的质粒标准品的扩增曲线图；
[0021]图5是RdRp基因序列的质粒标准品的标准曲线图；
[0022]图6是RdRp基因序列的质粒标准品的检测限图。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。
[0024]以下实施例中使用的主要试剂：引物及探针、pUC57载体、RdRp基因序列 合成产物、T4 DNA连接酶、连接酶buffer、感受态大肠杆菌DH5a、内切酶 Sma I(Blunt)、Amp
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LB液体培养基、氨苄青霉素(Amp)、5
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溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑ꢀ
半乳糖苷(X
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GaL)、异丙基
‑
β
‑
D
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硫代半乳糖苷(IPTG)、LB琼脂平板、质粒 快速提取试剂盒、TwistAmp exo RT试剂盒、灭菌三蒸水、MgAc。
[0025]以下实施例中使用的主要仪器：全自动核酸纯化仪、全外排式生物安全柜、 水浴锅、离心机、CO2培养箱、测序仪、摇床、等温扩增荧光检测仪。
[0026]实施例1：质粒标准品的制备方法
[0027]1、获得目的基因片段新冠病毒序列突变率较高，故选取标准品靶序列有一 定难度。通过筛选，选取新冠病毒开放读码框ORF1ab突变频率最低的区域序 列16000bp处上下游各600bp，作为目的基因片段并委托公司生物合成，如SEQID NO.1所示。
[0028]2、构建重组质粒
[0029]按照载体说明书将RdRp基因序列与pUC57载体在T4 DNA连接酶作用下 进行连接反应，构建重组质粒(图1)。连接体系为10μL，其反应组分为：pUC57 Vector(50ng)1μL、
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品，其特征在于，含有新冠病毒的RdRp基因序列，所述的RdRp基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品，其特征在于，所述的质粒标准品使用的载体是pUC57。3.权利要求1所述的新RPA检测新型冠状病毒的质粒标准品在新冠病毒检测试剂盒中作为阳性对照品的应用。4.RPA扩增权利要求1所述的RPA检测新型冠状病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旭东，汪桂华，赵春梅，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：