可区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种可区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法。此外，本发明专利技术并涉及用于区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的寡核苷酸对。酸对。酸对。

【技术实现步骤摘要】
可区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法


[0001]本专利技术涉及检测非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)的方法，特别是涉及使用寡核苷酸对检测ASFV并区分野毒株与疫苗株病毒的方法。

技术介绍

[0002]猪是全球最重要的经济动物之一。根据美国农业部统计，2018年全球主要养猪国的猪肉总产量达113,081千吨。猪肉的经济价值已超过千亿美金。然而，密集养殖加上管理不良可能造成猪只容易感染疾病且疫情迅速扩散。以2018年中国爆发的非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)为例，病猪死亡率几乎为100％，已经造成了巨大的经济损失。不幸的是，目前尚无药物可供治疗非洲猪瘟。
[0003]疫苗是防止病毒扩散的有效方法之一。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于2019年研发出一款基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗。所述疫苗是将基因II型的非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得MGF360
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505R基因缺失病毒(相对于原始毒株全长序列缺失了第27942
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35500位核苷酸)以及CD2V与MGF360
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505R基因联合缺失病毒(相对于原始毒株全长序列缺失了第27942
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35500位以及第73394
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74476位核苷酸)(细节请参阅中国专利申请公布号CN 110093324 A)。
[0004]除了以疫苗防止非洲猪瘟病毒扩散之外，在饲养场密集监控猪只是否感染非洲猪瘟病毒对管理而言也是不可或缺的一环。监控猪只是否感染非洲猪瘟病毒的方法之一为检测猪只检体中的非洲猪瘟病毒核酸含量。然而，若饲养场中的猪只施打例如上述减毒非洲猪瘟病毒疫苗，其体内将含有减毒非洲猪瘟病毒。若采用习知非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒(例如，中国专利申请公布号111020058A)，将无法区别检测结果呈现阳性的猪只为染病的猪只(检体内含有非洲猪瘟野毒株)或已施打疫苗的猪只(检体内含有非洲猪疫苗株毒株)，进而可能扑杀已施打疫苗的猪只，造成不必要的经济损失。因此，需要可区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法以供产业利用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的是提供一种区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法，包含：提供一可能含有一非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5'端，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates,dCTPs)、去氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，
以形成一聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；提供一稳定热源给所述容器，使所述PCR混合物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列，其中若所述寡核苷酸引物对SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5产生所述PCR产物，则代表所述样本中含有非洲猪瘟野毒株病毒；以及若所述寡核苷酸引物对SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11产生所述PCR产物，则代表所述样本中含有非洲猪瘟疫苗株病毒。
[0006]本专利技术的另一目的是提供一种区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法，包含：提供一可能含有一非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5'端，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates,dCTPs)、去氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；提供一稳定热源给所述容器，使所述PCR混合物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列，其中若所述寡核苷酸引物对SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5产生所述PCR产物，则代表所述样本中含有非洲猪瘟野毒株病毒；以及若所述寡核苷酸引物对SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11产生所述PCR产物，则代表所述样本中含有非洲猪瘟疫苗株病毒。
[0007]在某些实施方案中，所述非洲猪瘟疫苗株病毒为至少含有MGF360
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505R基因缺失的非洲猪瘟病毒。
[0008]在某些实施方案中，所述聚合酶链式反应(PCR)选自传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、热对流聚合酶链式反应(convective polymerase chain reaction,cPCR)，以及实时聚合酶链式反应(real
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time polymerase chain reaction,real
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time PCR)。
[0009]本专利技术的另一目的是提供一种用于侦测非洲猪瘟野毒株病毒的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法，包含：提供一可能含有一非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5'端，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates,dCTPs)、去氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；提供一稳定热源给所述容器，使所述PCR混合物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列，其中若所述寡核苷酸引物对SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5产生所述PCR产物，则代表所述样本中含有非洲猪瘟野毒株病毒；以及若所述寡核苷酸引物对SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11产生所述PCR产物，则代表所述样本中含有非洲猪瘟疫苗株病毒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗株病毒为至少含有MGF360
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505R基因缺失的非洲猪瘟病毒。3.一种区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法，包含：提供一可能含有一非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述非洲猪瘟野毒株或疫苗株病毒的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5'端，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11；提供一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制，其中所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:6所示；所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8时，所述寡核
苷酸探针序列如SEQ ID NO:9所示；以及所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:12所示；提供一聚合酶；在一管状容器中混合所述样本、所述寡核...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭村勇，李柏宽，
申请(专利权)人：先进应用技术有限公司，
类型：发明
国别省市：