检测新型冠状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及检测新型冠状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。本发明专利技术基于双重检测靶标，在同一检测体系中分别针对新型冠状病毒S基因和N基因为设计了检测引物探针组合物，并提供了包含该引物探针组合物的新型冠状病毒检测试剂盒及非疾病诊断目的的检测方法，具有敏度性高、重复性好、特异性强、检测速度快、结果客观、高通量等优点。本发明专利技术提供的试剂盒和非疾病诊断目的的检测方法不仅能够实现定性检测，还能够对待检样本的核酸浓度作出客观的、定量的检测，对检测样品的病毒含量进行准确判定，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
检测新型冠状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及检测新型冠状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)属于冠状病毒科，β类冠状病毒，是一种有包膜、基因组为线性非节段单股正链RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径为120
‑
160nm，基因组全长约30kb。目前已完成多株新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
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2)的全基因组序列测定，SARS
‑
CoV
‑
2与SARS 基因组相似性为80％左右。
[0003]人感染新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)的一般症状是发热、乏力、干咳，一些严重的临床症状有急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍等。因此，SARS
‑
CoV
‑
2的快速、可靠检测至关重要，SARS
‑
CoV
‑
2的快速检测不仅是SARS
‑
CoV
‑
2 防控所必需的，也是与其临床症状类似的SARS、MERS等呼吸系统疾病进行鉴别诊断所必需的。
[0004]目前，对新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)检测方法有聚合酶链反应、恒温扩增芯片法、胶体金法抗体检测等。其中恒温扩增芯片法、胶体金法抗体检测的敏感性不高和特异性不强。聚合酶链反应(PCR)是一种快速检测SARS
‑
CoV
‑
2的方法，特别适用于筛选质量较差或降解的带有不可恢复病毒的样本。PCR技术使SARS
‑
CoV
‑
2的诊断能够在收样后数小时内完成，缩短了诊断时间。PCR检测新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等特点。
[0005]目前的SARS
‑
CoV
‑
2核酸检测试剂盒大多基于RT
‑
qPCR检测技术，其检测引物探针均是针对单一靶基因设计。但是，病毒单碱基突变的频率约为10
‑6，核酸序列变异程度高，易产生由于突变导致的假阴性检测结果。目前检测技术存在灵敏度低的问题，因此需要提高灵敏度消除假阴性结果。因此，亟需研发新的、高效准确的检测新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)方法，以用于检测疑似病例及待确诊病例中SARS
‑
CoV
‑
2的核酸。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供用于检测新型冠状病毒的引物探针组合物，以解决现有检测技术可靠性和灵敏度差的技术问题。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供包含上述引物探针组合物的新型冠状病毒定性检测试剂盒。
[0008]本专利技术的第三个目的在于提供包含上述引物探针组合物的新型冠状病毒定量检测试剂盒。
[0009]本专利技术的第四个目的在于提供非诊断目的的新型冠状病毒定性检测方法。
[0010]本专利技术的第五个目的在于提供非诊断目的的新型冠状病毒定量检测方法。
[0011]本研究旨在建立一种更灵敏、更可靠、成本更低、速度更快的单步多重逆转录实时
定量 PCR检测方法，利用刺突蛋白(S)基因和核蛋白(N)基因中的高变区，这些引物用于区分 SARS
‑
CoV
‑
2病毒与流感病毒和其他冠状病毒，设计用于荧光探针封闭管检测的引物。探针的合并可以识别PCR产物的特异性，并允许自动读取反应。
[0012]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0013]用于检测新型冠状病毒的引物探针组合物，包括以S基因为靶标的第一引物探针和以N 基因为靶标的第二引物探针；所述第一引物探针包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物、如 SEQ ID NO：6所示的下游引物和S基因检测探针，所述S基因检测探针核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，5
’
端标记荧光报告基团FAM，3
’
端标记荧光淬灭基团MGB；所述第二引物探针包括如SEQ ID NO：7所示的上游引物、如SEQ ID NO：8所示的下游引物和N基因检测探针，所述N基因检测探针核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，5
’
端标记荧光报告基团 VIC，3
’
端标记荧光淬灭基团MGB。
[0014]新型冠状病毒定性检测试剂盒，包括RT
‑
qPCR反应混合液，所述RT
‑
qPCR反应混合液包括上述引物探针组合物。
[0015]新型冠状病毒定量检测试剂盒，包括RT
‑
qPCR反应混合液，所述RT
‑
qPCR反应混合液包括上述引物探针组合物，还包括新型冠状病毒SARS
‑
CoV
‑
2RNA标准品，所述RNA标准品的序列如SEQ ID NO：10所述。
[0016]优选的，每20μL RT
‑
qPCR反应混合液包括如下组分：250nM如SEQ ID NO：3和4所示的两种分子探针各0.5μL；900nM如SEQ ID NO：5和7所示的上游引物各0.5μL；900nM 如SEQ ID NO：6和8所示的下游引物各0.5μL；4
×
TaqPath
TM1‑
Step Multiplex Master Mix 12.5μL；Nuclease
‑
free water 3μL。
[0017]优选的，上述定性或定量检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为包含如SEQ ID NO： 9所示核苷酸序列的阳性质粒。
[0018]优选的，上述定性或定量检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为Nuclease
‑
free water。
[0019]非诊断目的的新型冠状病毒定性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0020]1)提取待检样本RNA；
[0021]2)以待测样本的RNA为模板，采用上述定性或定量检测试剂盒进行RT
‑
qPCR反应；
[0022]3)结果判定：若RT
‑
qPCR检测两个靶标的Ct值均>30，则待检样品为阴性；若RT
‑
qPCR 检测两个靶标的Ct值均<30，则待检样品为阳性；其他情况，待检样品为疑似样品，需要再次检测。
[0023]优选的，采用Trizol法提取待检样本的RNA。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测新型冠状病毒的引物探针组合物，其特征在于，包括以S基因为靶标的第一引物探针和以N基因为靶标的第二引物探针；所述第一引物探针包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物、如SEQ ID NO：6所示的下游引物和S基因检测探针，所述S基因检测探针核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，5
’
端标记荧光报告基团FAM，3
’
端标记荧光淬灭基团MGB；所述第二引物探针包括如SEQ ID NO：7所示的上游引物、如SEQ ID NO：8所示的下游引物和N基因检测探针，所述N基因检测探针核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，5
’
端标记荧光报告基团VIC，3
’
端标记荧光淬灭基团MGB。2.新型冠状病毒定性检测试剂盒，其特征在于，包括RT
‑
qPCR反应混合液，所述RT
‑
qPCR反应混合液包含权利要求1所述的引物探针组合物。3.新型冠状病毒定量检测试剂盒，其特征在于，包括RT
‑
qPCR反应混合液，所述RT
‑
qPCR反应混合液包含权利要求1所述的引物探针组合物，还包括新型冠状病毒SARS
‑
CoV
‑
2RNA标准品，所述RNA标准品的序列如SEQ ID NO：10所示。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，每20μL RT
‑
qPCR反应混合液包括如下组分：250nM如SEQ ID NO：3和4所示的两种分子探针各0.5μL；900nM如SEQ ID NO：5和7所示的上游引物各0.5μL；900nM如SEQ ID NO：6和8所示的下游引物各0.5μL；4
×
TaqPath
TM1‑
Step Multiplex Master Mix 12.5μL；Nuclease
‑
free wa...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱萍，贾蕊，张改平，刘东民，刘红亮，丁培阳，冯华，王彦伟，田媛媛，马红芳，
申请(专利权)人：河南中泽生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：