本发明专利技术涉及一种转基因动物毛色报告基因表达载体构建及其应用。该表达盒是由依次串联的两个人TYR增强子，人TYR启动子，小鼠TYR基因和bGH polyA组成；其序列如SEQ ID NO.13所示。本发明专利技术还公开了含有该表达盒的表达载体，将表达载体转入毛色为白色的宿主动物基因组，转基因表达后，产生黑色素沉积，能够在宿主动物的皮肤、毛发等部位肉眼直接观察到毛色变化，直接反应目的基因表达情况。应用本发明专利技术中构建的载体，以小白鼠为宿主动物制备转基因鼠，成功获得转基因后代，并观察到毛色变化，获得黑鼠，表明该载体可以作为报告基因应用。
【技术实现步骤摘要】
一种转基因动物毛色报告基因表达盒、表达载体及应用
本专利技术涉及一种转基因动物毛色报告基因表达载体构建及其应用。
技术介绍
在转基因动物制备过程中，经常会使用到报告基因来“报告”目的基因相关的表达情况。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因、β-乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、荧光蛋白基因等，其中用于活体检测转基因动物的常用报告基因主要为荧光蛋白基因。荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20～30kD的同源性蛋白，包括绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白等。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是其中应用的最多的一种，最初是从维多利亚发光水母(Aequoreavictoria)中分离得到。由于对GFP研究及应用的突出贡献，下村修、马丁·莎尔菲、钱永健3位学者共同获得了2008年的诺贝尔化学奖。利用GFP作为报告基因的优点是在395nm的紫外光和475nm的蓝色激发光激发下，可在508nm处自行发射绿色荧光，不需要辅助因子和底物，且GFP相对分子质量小、荧光稳定、对活细胞无害、检测方法容易，可以用于活体动物检测。缺点是：肉眼不可见，需要蓝色激发光激发，需要实验室配备荧光显微镜或者蓝色激发光激发设备，对于检测大型动物比较困难，需要配置较大的蓝色激发光激发设备，成本较高等。酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是动物体黑色素细胞中黑色素合成的关键酶，TYR基因编码序列长1592bp。它是一个含铜的氧化还原酶,催化酪氨酸氧化成多巴(dopa)，进一步将多巴氧化成多巴醌(dopaquinone)，多巴醌经过一系列的生化反应最终合成黑色素。毛色白色的大鼠、小鼠、家兔、猪等动物中酪氨酸酶发生功能性突变，黑色素无法沉积，产生白化特征，从而呈现白色毛色性状。因此，可以利用野生型TYR基因作为肉眼可见的报告基因，即利用转基因技术，在毛色白色动物中转入野生型TYR基因，使之在皮肤组织中表达野生型TYR基因，表达后动物皮肤组织一定程度上恢复黑色素沉积，出现黑色表型，达到报告转基因表达的目的。TYR基因作为报告基因的优点是检测方便、快捷，检测成本低，动物表型明显，易于观察，不需要配备荧光显微镜等高端仪器，可以广泛应用于转基因动物制备效率评估和基因捕获等功能基因组学研究等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测方便、快捷，检测成本低，肉眼可见的毛色报告基因表达盒、载体及应用。本专利技术公开了一种转基因动物毛色报告基因表达盒，该表达盒是由依次串联的两个人TYR增强子，人TYR启动子，小鼠TYR基因和bGHpolyA组成；其序列如SEQIDNO.13所示。本专利技术中所述的毛色报告基因表达盒是由依次串联的2个人TYR增强子，人TYR启动子，小鼠TYR基因和牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸(polyA)组成；所述人TYR增强子克隆自人基因组，长度为204个核苷酸序列，能够在皮肤组织中特异增强目标基因表达；所述人TYR启动子克隆自人基因组，长度为262个核苷酸序列，能够驱动TYR基因在皮肤组织中特异表达；所述小鼠TYR基因克隆自小鼠基因组cDNA，全长为1592个核苷酸序列；所述bGHpolyA克隆自质粒pT3-PGK-NEO，长度为232bp。本专利技术还公开了一种转基因动物毛色报告基因表达载体，该载体含有上述的转基因动物毛色报告基因表达盒。本专利技术公开了序列如SEQIDNO.13的基因表达盒作为毛色报告基因的应用。具体是：将含有所述基因表达盒的表达载体转入毛色为白色的宿主动物基因组，转基因表达后，转基因宿主动物的皮肤组织的黑色素沉积恢复，产生毛色变化，肉眼可直接观察转基因的表达情况。本专利技术进一步公开了上述转基因动物毛色报告基因表达盒在制备转基因动物中的应用。转基因宿主动物的皮肤组织的黑色素沉积恢复，产生毛色变化，肉眼可直接观察转基因的表达情况。所述宿主动物的背景毛色为白色。本专利技术所述的表达载体优点在于将表达载体转入毛色为白色的宿主动物基因组，转基因表达后，产生黑色素沉积，能够在宿主动物的皮肤、毛发等部位肉眼直接观察到毛色变化，直接反应目的基因表达情况。应用本专利技术中构建的载体，以小白鼠为宿主动物制备转基因鼠，成功获得转基因后代，并观察到毛色变化，获得黑鼠，表明该载体可以作为报告基因应用。附图说明图1：PCR扩增bGHpolyA产物电泳图；图2：PCR扩增TYR增强子1产物电泳图；图3：PCR扩增TYR增强子2产物电泳图；图4:PCR扩增TYR启动子产物电泳图；图5:PCR扩增TYR基因产物电泳图；图6：phEN-Pro-TYR质粒酶切产物电泳图；图7：pLB-PG-TYR质粒酶切产物电泳图；图8：pLB-PG-TYR载体示意图图9：PCR鉴定转基因小鼠TYR基因产物电泳图；图10：转基因小鼠5日龄照片。具体实施方式下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。pT3-PGK-NEO质粒公开于下述文献：沈丹,谢雨琇,李庆平,等.多转座子载体的构建及转座特性比较研究.中国农业科学,2015,48(11):2270-2278.；申请人可向公众提供。实施例I、毛色报告基因表达载体pPG-TYR的构建1、phEN-Pro-TYR载体构建首先采用高保真PCR法以pT3-PGK-NEO质粒为模板克隆bGHpolyA(引物序列：bGHpAF:TctagaCtagagctcgctgatcagcc(SEQIDNO.1)；bGHpAR:TctagaCatatgtccccagcatgcctgctatt(SEQIDNO.2))，反应体系为50l，10μL5×SFBuffer、1ldNTP、2μL10μMbGHpAF、2l10μMbGHpAR、1μLPhantaTMSuper-Fidelity，1μlpT3-PGK-NEO(5ng)为模板，加超纯水至50μL(高保真酶购自诺唯赞公司)。PCR扩增程序：94℃40s，55℃40s，72℃30s，循环30次。PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测(如图1)。将PCR产物琼脂糖凝胶回收，与T载体(购自天根生化科技有限公司)连接，进行TA克隆，筛选出阳性克隆测序，测序比对正确后保存供下一步连接用。TA克隆方法同上，采用高保真PCR法，分别以人基因组、小鼠基因组cDNA为模板克隆人TYR增强子、人TYR启动子，小鼠TYR基因，引物序列如下：hTyr-ENAF:CATATGACGCGTaattctgtcttcgagaacat(SEQIDNO.3)；hTyr-ENAR:GAATTCccatggaaatgctgcctctgg；(SEQIDNO.4)hTyr-ENBF:GAATTCaattctgtcttcgagaacat；(SEQIDNO.5)hTyr-ENBR:GATATCccatggaaatgctgcctctgg；(SEQIDNO.6)hTyr-ProF:GATATCattctaaccataagaattaa；(SEQIDNO.7)hTyr-ProR:GCGGCCGCcaggaactggctaattggag；(SEQIDNO.8)TyrCDF:gcggccgcCTAAAGGAGAAAATGTTCTTGGCTG；(SEQIDNO.9)TyrCDR:tctagaTCACAGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转基因动物毛色报告基因表达盒，其特征在于，该表达盒是由依次串联的两个人TYR增强子，人TYR启动子，小鼠TYR基因和bGH polyA组成；其序列如SEQ ID NO.13所示。
【技术特征摘要】
1.一种转基因动物毛色报告基因表达盒，其特征在于，该表达盒是由依次串联的两个人TYR增强子，人TYR启动子，小鼠TYR基因和bGHpolyA组成；其序列如SEQIDNO.13所示。2.一种转基因动物毛色报告基因表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的转基因动物毛色报告基因表...
【专利技术属性】
技术研发人员：高波，沈丹，宋成义，陈伟，陈才，王赛赛，王伟，张丽，王宵燕，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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