对抗肠病毒感染的基于腺病毒载体的疫苗制造技术

本发明专利技术关于一种重组腺病毒载体，可用于产生免疫力以对抗肠病毒感染。于一具体实施例中，本发明专利技术之重组腺病毒载体包含一表现卡匣，其编码肠病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶。于另一具体实施例中，本发明专利技术重组腺病毒载体包含一表现卡匣，其编码肠病毒之3C蛋白酶或3CD蛋白酶。本发明专利技术亦关于一种疫苗组合物，包含所述之重组腺病毒载体。本发明专利技术提供一种使用该重组腺病毒载体及疫苗组合物以诱发个体产生免疫反应，对抗肠病毒感染的方法。进一步提供一种产生肠病毒之类病毒颗粒之方法，系藉由表现本文所述之腺病毒载体于哺乳动物细胞中。

Adenovirus based vaccine against enterovirus infection

The present invention relates to a recombinant adenovirus vector that can be used to generate immunity against enterovirus infections. In one embodiment, the invention of the recombinant adenovirus vector containing the expression cassette, the intestinal virus encoding P1 protein and 3CD protein. In another embodiment, the invention includes a recombinant adenovirus vector encoding the expression cassette, intestinal virus 3C protease or 3CD protease. The present invention also relates to a vaccine composition comprising the recombinant adenovirus vector. The present invention provides a method of using the recombinant adenovirus vector and a vaccine composition to induce an individual to produce an immune response against enterovirus infections. A method of producing viral particles such as enteroviruses is also provided in mammalian cells by the expression of adenoviral vectors described herein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对抗肠病毒感染的基于腺病毒载体的疫苗相关申请案本案基于35U.S.C.§119(e)，主张基于美国临时专利申请案第61/985,803号于2014年4月29日提出申请的之优先权，其文中所有内容皆以参考文献方式引入本文中。
本专利技术一般关于免疫领域，以及具体地，关于对抗肠病毒感染之基于腺病毒载体之疫苗。
技术介绍
肠病毒，属于微小核糖核酸病毒科，为一种微小、无封套之含有正股RNA之病毒种类。肠病毒属，现包含12种：肠病毒A、肠病毒B、肠病毒C、肠病毒D、肠病毒E、肠病毒F、肠病毒G、肠病毒H、肠病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B及鼻病毒C。该等病毒感染肠道，却可造成各种类型之疾病。典型的肠病毒疾病为脑膜炎、麻痹、心肌炎、手足口病(hand,footandmouth-disease；HFMD)、疱疹性咽峡炎、胸膜痛、肝炎、急性呼吸性疾病(包括肺炎)。目前唯一用于人类之肠病毒疫苗为脊髓灰质炎病毒疫苗，其属于肠病毒C型。目前尚无可供人类使用之对抗非脊髓灰质炎肠病毒疫苗。于肠病毒A型间，肠病毒71(enterovirus71；EV71)及克沙奇病毒A群(coxsackievirusAgroup；CVA)感染系最常见造成手足口病(HFMD)及其他神经性疾病之主因。许多神经性疾病，包括脑炎、急性无力肢体麻痹、肺水肿(pulmonaryedema；PE)、及出血、最终导致死亡，尤其是当EV71感染到5岁以下之幼童时，皆有报告过相关病例[1-5]。因为EV71及CVA感染可能对于全球公共健康造成新的危害[1,6-11]，因此，亟需一有效的抗病毒药物及预防性疫苗。肠病毒基因组由单股的开放阅读框架所组成，其编码P1、P2及P3聚合蛋白。该P2及P3区编码非结构性蛋白(如3CD)，该蛋白负责病毒之复制及致病性。于病毒RNA转译时，2A蛋白可催化其之顺式N端切位，藉此从P2及P3区之初生非结构性蛋白中，释放P1区中之壳体蛋白。藉由自主酶切方式，将3CD从P3前驱物中释放。有一个3C’切位，位于3CD之3C及3D部分间之多蛋白残基中，以生成2个产物，3C’、及3D’。当P1前驱物由P1区编码时，其可被3C’蛋白酶切割为VP0、VP1及VP3。该3个蛋白自动地组装成二十面体之前壳体，并将RNA基因组装入该前病毒颗粒中，可成为一非感染性之空的(E)颗粒或具感染性之完整的(F)颗粒[12,13]。人类清道夫受体B类成员2(humanscavengerreceptorclassB,member2；hSCARB2)，及人类P分泌素糖蛋白配体1(P-selectinglycoproteinligand1；PSGL-1)已知为EV71感染时重要之细胞受体[14,15]。吾人团队[16]及Fujii等人[17]已成功发展可表现人类hSCARB2受体之转殖基因小鼠。于此有希望之模式中，将临床EV71分离株(B4及B5亚基因型)感染至该转殖基因动物中，可发展类HFMD皮肤疹，而接种EV71C2及C4亚基因型或CVA16者，患有严重的肢体麻痹及死亡。此外，将单株抗EV71VP1中和抗体N3[26]以被动施予方式给予，可降低EV71B5感染所诱发之症状及保护该转殖基因小鼠，对抗EV71C2诱发之严重的肢体麻痹及死亡。于先前研究中[13]，吾人制备一种福尔马林不活化之EV71E59株(formalin-inactivatedEV71；FI-EV71)候选疫苗，其系与铝胶佐剂混合，并发现FI-EV71于hSCARB2-Tg小鼠攻毒模式中，展现效力[16]。于第一期人类临床试验中[18]，FI-EV71为安全的，且可诱发高度之中和抗体反应，以对抗目前常在之EV71分离株，但无法保护对抗CVA16之感染。另一方面中，相较于该不活化病毒疫苗，基于VP1(于EV71病毒中最重要之有效抗原)之DNA疫苗(100μg/小鼠)及重组蛋白疫苗(10μg/小鼠)，诱发较差的免疫反应，且无法有效保护小鼠对抗病毒感染[19]。类病毒颗粒，或VLPs，可仿真病毒之外蛋白结构，且不含有遗传物质(DNA或RNA)，该遗传物质负责病毒之复制。没有了遗传物质，VLP疫苗自己则无法进行感染，且可同时以最真实之构型来呈现病毒抗原。EV71之VLPs由昆虫细胞生产，亦被证明于小鼠中之效力[20]，其中说明了VLP蛋白可于昆虫细胞中表现，且组装成VLPs，经纯化后，将该VLPs引入小鼠以进行免疫，来诱发免疫反应对抗病毒攻毒。然而，由非人类细胞生成之VLPs蛋白，其具有不同之后修饰作用(像是糖化作用)，可能于人类中诱发不同之免疫原性。此外，于生产高度纯化之VLPs时亦遇上阻碍。因此，目前仍亟需开发一有效之疫苗以对抗肠病毒感染。
技术实现思路
本专利技术关于一种新颖的基于腺病毒载体之DNA疫苗，用来生成免疫力以对抗肠病毒感染。于一具体实施例中，本专利技术提供一种重组腺病毒载体，包含表现卡匣，其编码肠病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶。于另一具体实施例中，本专利技术提供一种重组腺病毒载体，包含表现卡匣，其编码肠病毒之3C蛋白酶或3CD蛋白酶。吾人不可预期地发现，本文所述之重组腺病毒载体之疫苗，可诱发增强的保护性免疫力，以对抗肠病毒感染，尤其是细胞的(T细胞)免疫反应。吾人亦发现本文所述之重组腺病毒载体之疫苗，可诱发专一3C之细胞免疫反应，因此可提供广效之交叉保护力，以对抗不同种的肠病毒，至少包括肠病毒71及克沙奇病毒A，系因为3C蛋白酶之氨基酸序列于各种肠病毒间系高度保留的。因此，于一方面，本专利技术提供一种重组病毒载体，可生成免疫力以对抗肠病毒感染，其包含表现卡匣，编码肠病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶。本专利技术亦提供一种重组腺病毒载体，可生成免疫力以对抗肠病毒感染，包含表现卡匣，其编码肠病毒之3C蛋白酶或3CD蛋白酶。于又一方面中，本专利技术提供一种疫苗组合物，用于生成免疫力，以对抗肠病毒感染，其包含有效量之本文所述的重组腺病毒载体。于再一方面中，本专利技术提供一种于个体中诱发免疫反应以对抗肠病毒感染之方法，包含施予该个体一有效量之本文所述重组腺病毒载体或疫苗组合物。本专利技术亦提供本文所述之该重组腺病毒载体或疫苗组合物，于制造一医药(如疫苗)以于个体中诱发免疫反应，以对抗肠病毒感染之用途。此外，吾人发现使用本专利技术之编码P1及3CD蛋白之重组腺病毒载体，于哺乳动物细胞表现系统中，可形成类病毒颗粒。因此，本专利技术进一步提供一种产生肠病毒之类病毒颗粒之方法，包含：于可表现该P1蛋白及3CD蛋白酶且可组装该肠病毒之类病毒颗粒的环境中，培养哺乳动物细胞，该细胞经本文所述之重组腺病毒载体所转染；以及收集培养后之哺乳动物细胞，并从中分离出肠病毒之类病毒颗粒。本专利技术之一种或多种具体实施例之细节，系描述于以下说明书中。本专利技术之其他特征或优点，可配合以下许多具体实施例之详细说明以及所附之申请专利范围得以明晰。附图说明先前摘要，以及以下本专利技术之详细说明，当阅读时可配合所附图式可使人更佳理解其内容。该等于图式中之较佳具体实施例，系为阐述本专利技术之目的。然而，应可理解的是，本专利技术不受限于该等所述之明确排列方式及手段。图式中：图1为一携带EV71P1及3CD基因之重组腺病毒载体之构筑，且该载体可表现出VLPs。(A)腺病毒构筑体；表现P1基因之Ad-EVVLP，其由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒载体，可用于产生免疫力以对抗肠病毒感染，包含表现卡匣，其编码肠病毒的P1蛋白及3CD蛋白酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.29 US 61/985,8031.一种重组腺病毒载体，可用于产生免疫力以对抗肠病毒感染，包含表现卡匣，其编码肠病毒的P1蛋白及3CD蛋白酶。2.如权利要求1的重组腺病毒载体，其中该重组腺病毒载体是无法进行复制的。3.如权利要求1的重组腺病毒载体，其中该P1蛋白或3CD蛋白酶源自肠病毒71(EV71)。4.如权利要求1的重组腺病毒载体，其中该P1蛋白具有如SEQIDNO:1的氨基酸序列，或与SEQIDNO:1至少有85％、90％或95％相同性的氨基酸序列。5.如权利要求1的重组腺病毒载体，其中该3CD蛋白酶具有如SEQIDNO:2的氨基酸序列，或与SEQIDNO:2至少有85％、90％或95％相同性的氨基酸序列。6.如权利要求1的重组腺病毒载体，其中该表现卡匣包括第一核酸片段，其编码P1蛋白，及第二核酸片段，其编码3CD蛋白酶。7.如权利要求6的重组腺病毒载体，其中该第一核酸片段与第一启动子操作式连接，以控制该P1蛋白的表现；以及第二核酸片段与第二启动子操作式连接，以控制该3CD蛋白酶的表现，其中该第一启动子及第二启动子可为相同的或不同的启动子。8.如权利要求7的重组腺病毒载体，其中该第一启动子及第二启动子独立选自由巨细胞病毒启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、T7启动子、乙醇氧化酶基因(AOX1)启动子、内部核醣体进入位(IRES)及延长因子1a启动子所组成的群组。9.如权利要求7的重组腺病毒载体，其中该表现卡匣包括SEQIDNO:3或4的核酸序列。10...

【专利技术属性】
技术研发人员：周彦宏，邹岳良，庄再成，
申请(专利权)人：财团法人卫生研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71