制备用于以体外转译的方法体外测B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂的用途与体外诊断套组技术

本发明专利技术揭示一种于体外侦测一分离出的核苷酸检体具有一B型肝炎病毒表面抗原基因C端截断突变的方法。本发明专利技术亦揭示利用上述方法的体外诊断套组。

【技术实现步骤摘要】
制备用于以体外转译的方法体外测B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂的用途与体外诊断套组
本专利技术原则上关于肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)，特别是与B型肝炎病毒有关的肝细胞癌。
技术介绍
B型肝炎病毒表面抗原基因(GeneSofhepatitisBvirus)负责编码表面抗原HBsAg。该B型肝炎病毒表面抗原基因(HBsAggene)为一个长的开放转录区(longopenreadingframe)，但该转录区内有3个起始密码子(startcodon,ATG)，进而将该HBsAg基因分成3个部分—pre-S1、pre-S2和S。因为具有多个起始密码子，该基因负责编码的多胜肽共有3种不同的大小—大(large)S、中(middle)S和小(small)S；其中大S是由pre-S1+pre-S2+S来编码，中S是由pre-S2+S来编码，小S是由S来编码。在慢性B型肝炎感染的过程中，病毒基因组经常会发生突变。这些突变是因为这些病毒试图要逃脱寄主的免疫监视(hostimmune-surveillance)。B型肝炎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.第一组引子对和第二组引子对的组合在制备用于以体外转译的方法体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂的用途，其特征在于，包括：/na)提供第一组引子对和第二组引子对：该第一组引子对包括一选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的群组的核苷酸序列的第一前置引子和一包括SEQ ID NO:9核苷酸序列的反置引子；该第二组引子对包括一选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的核苷酸序列的第二前置引子和一包括SEQ ID NO:9核苷...

【技术特征摘要】
1.第一组引子对和第二组引子对的组合在制备用于以体外转译的方法体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂的用途，其特征在于，包括：
a)提供第一组引子对和第二组引子对：该第一组引子对包括一选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16组成的群组的核苷酸序列的第一前置引子和一包括SEQIDNO:9核苷酸序列的反置引子；该第二组引子对包括一选自由SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17组成的核苷酸序列的第二前置引子和一包括SEQIDNO:9核苷酸序列的反置引子；其中，
(i)该第一前置引子包括一段可黏合至S基因5'-端的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'-端标记有一FLAG标记序列；该反向引子具有可黏合至S基因3'-端序列的特征；该第一组引子对具有产生一第一次聚合酶连锁反应产物的特征，该产物的5'-端具有一FLAG标记序列；
(ii)该第二前置引子包括一方向为5'端至3'端的一T7或一Sp6启动子序列、一Kozak序列及一3'-端序列，该3'-端序列可黏合至第一次PCR产物5'-端FLAG标记序列；而该第二组引子对具有产生第二次PCR产物的特征：其5'-端具有T7或Sp6启动子序列、具有Kozak序列和FLAG标记序列，其中该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括一分离出的核苷酸检体和第一组引子对来产生第一次PCR产物，其中该分离出的核苷酸检体来自于B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者；
c)于一第二反应混合物中进行一第二次PCR，该混合物包括第一次PCR产物和第二组引子对来产生第二次PCR产物；
d)将该第二次PCR产物转译成一蛋白质；
e)将该蛋白质的尺寸与控制组或野生型小表面蛋白的尺寸进行比较；及
f)检测该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因C端截断突变：当该蛋白质的尺寸相较于控制组或野生型的小表面蛋白尺寸有变小的状况，则该检体具有B型肝炎表面基因的C端截断突变，其中该HBVS基因的C-端截断突变选自由sL95*、sW182*和sL216*组成的群组。


2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该核苷酸样本取自一疑似受到B型肝炎病毒感染或肝细胞癌的病患、或肝功能不正常的病患、或有肝硬化的病患。


3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该核苷酸样本萃取自于一新鲜的冷冻肝组织、一福尔马林固定的石蜡组织切片或一血液样本。


4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该第一次PCR产物延展HBVS基因以编码小表面蛋白序列，该序列延展的范围至少为编号2号氨基酸序列(SEQIDNO:2)的氨基酸位置123到227的长度；且该第一次PCR产物的5'-端标示有一FLAG标记序列。


5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该第一次PCR产物延展HBVS基因中负责编码小表面蛋白的序列，该序列延展的范围由SEQIDNO:2的氨基酸位置30到227，或由SEQIDNO:2的氨基酸位置123到227。


6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该Kozak共有序列为SEQIDNO:5或SEQIDNO:6。


7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该第一前置引子和该第二前置引子分别包括选自由下列群组所组成的核苷酸序列：
(a)SEQIDNO:8和10；
(b)SEQIDNO:11和12；
(c)SEQIDNO:8和12；
(d)SEQIDNO:13和12；
(e)SEQIDNO:13和10；
(f)SEQIDNO:14和12；
(g)SEQIDNO:14和15；
(h)SEQIDNO:14和10；及
(i)SEQIDNO:16和17。


8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，该第一前置引子的序列为SEQIDNO:14，该第二前置引子的序列为SEQIDNO:15。


9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
a)该第一组引子对的第一前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16组成的群组；
b)该第二组引子对的第二前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17组成的群及
c)该反置引子由SEQIDNO:9核苷酸序列组成。


10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该比较步骤是以一西方点墨法或一化学发光检测系统来做比较。


11.第一前置引子和反置引子以及第二前置引子和反置引子的组合在制备用于体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的用途，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄秀芬，叶昭廷，陈雅婷，
申请(专利权)人：财团法人卫生研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71