CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法技术

本发明专利技术提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，通过根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；然后环状空质粒酶切后，酶切片段连接PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法。
技术介绍
当前在世界范围内肺癌发病率逐年上升，每年大约有超过一百万人死于肺癌，已成为恶性肿瘤最常见死因之一，肺癌约30%患者在病程中出现颅脑转移，脑转移瘤自然生存时间为1～3个月，是恶性肿瘤严重并发症之一，颅脑转移为肺癌死亡的重要原因之一。趋化因子是一类具有生物化学趋化性的细胞因子，其中SDF-1及其特异性受体 CXCR4在肿瘤细胞的迁移与侵袭中发挥了重要的作用。研究显示 SDF-1及其受体CXCR4组成的信号传导通路可能与肺癌的发生、发展及颅脑转移关系密切。在非小细胞肺癌早期诊断和治疗中，侵袭和转移是非小细胞肺癌治疗效果不佳的主要因素。为了更好的研究CXCR4/SDF-1生物学轴在非小细胞肺癌侵袭及转移特别是脑转移中的作用，本研究采用具有脑转移潜能的肺癌细胞PC-9构建细胞模型，通过设计针对CXCR4基因序列的shRNA片段，构建慢病毒shRNA干扰表达载体，从而特异性的靶向沉默肺癌细胞CXCR4基因的表达。慢病毒介导的shRNA干扰的特点是高效、稳定且静默持续时间长，为进一步研究SDF-1/CXCR4生物学轴在非小细胞肺癌颅脑转移中的作用提供了工具。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：CXCR4RNAi慢病毒载体，所述载体含有CXCR4基因片段。CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，包括如下：（1）干扰序列设计：根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；同时设计一对对照序列siRNAc；（2）慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC-LV 带有 GFP标记，将PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒用BamH 和EcoR 限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段，连接空PLVX.1载体（来自clontech公司）与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒；（3）QPCR筛选shRNA：CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，培养293细胞，将质粒和lipo2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细胞的RNA，将RNA反转录为cDNA，利用cDNA为模板，利用所述QPCR引物检测CXCR4基因的相对表达量，荧光定量检测各组引物；PCR反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s。步骤（3）中所述QPCR引物序列为： Primer（＋）:5’GGAGAGTTGTAGGATTCTAC-3’，Primer(-):5’-CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG-3’。PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒是由clontech公司载体PLVX-shRNA2改造的，具体方式是:扩增puro表达框，将puro表达框克隆至PLVX-shRNA2载体ZSgreen后面。公认的绿色强荧光蛋白，本领域技术人员可以按此方法获得该质粒。本专利技术的优点在于：慢病毒载体和逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等相比，具有以下的优点：（1）可感染分裂期细胞与非分裂期细胞，如神经系统、造血系统等非分裂期细胞，免疫反应较小；（2）可转移基因片段较大，可插入约10 kb 的基因片段；（3）病毒突变与产生有复制能力的病毒机率较小，大大减少了产生有复制能力的病毒（replication competent virus，RCV）；（4）目的基因和宿主基因组通过整合，可实现目的基因较长时间的表达。基因治疗中的RNA干扰技术已成为肿瘤治疗的新方法，慢病毒载体能安全将肿瘤目的基因转移到机体。通过慢病毒载体介导的RNAi技术，发现与疾病相关的影响因素，并尝试由此着手研究治疗的方法，达到治疗疾病的效果。为此还应该保证更高的安全性、 有效性和可靠性，并逐步从体外实验和动物实验进入到临床试验阶段，相信该技术将在今后的研究领域和临床实际应用方面有着更广阔的前景。附图说明图1 CXCR4-shRNA阳性克隆PCR鉴定图，1：阴性对照（ddH2O）；2:Marker；3-8:CXCR4-shRNA克隆。图2各组293细胞中CXCR4表达变化（,n=3），*P < 0.01,**P =0.192 >0.05)。具体实施方式 1材料与方法1.1材料人肺腺癌PC9细胞株购自上海玉博生物科技有限公司。细胞用DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培养基，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中常规培养。CXCR4兔多克隆抗体、GAPDH鼠多抗购自abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自abcam公司1.2方法1.2.1 干扰序列设计根据GenBank CXCR4的mRNA全序列（Accession No：NM_003467），经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到3条19nt靶序列。然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链。同时设计一对对照序列siRNAc。然后根据siRNA的序列设计合成两条shRNA寡核苷酸单链。设计如下：BamH 酶切位点+19 nt靶核苷酸序列+茎环结构（TTCAAGAGA）+靶序列互补序列+RNA Poly聚合酶转录中止位点（TTTTTT）+EcoR 酶切位点六个区域，分别命名为shRNA1、shRNA2 、shRNA3、，以及shRNAc，具体序列见表1。shRNA寡核苷酸链由上海生工公司合成。表1. CXCR4基因的3条特异性SiRNA靶序列1.2.2 慢病毒表达载体的构建及鉴定空载体pGC-LV 带有 GFP标记。将PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒用BamH 和EcoR 限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段。连接空PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体分别标记为：PLVX-CXCR4shRNA1、PLVX-CXCR4shRNA2、PLVX-CXCR4shRNA3、PLVX-CXCR4shRNAc。连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α。37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，送上海生工进行DNA测序鉴定。测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。1.2.3 QPCR筛选最佳干扰效果的shRNACXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，序列为Primer（＋）:5,’GGAGAGTTGTAGGATTCTAC3’，Primer(-):5’CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3’，培养293细胞，将质粒(pLVX-CXC本文档来自技高网...

【技术保护点】
CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下：（1）干扰序列设计：根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；（2）慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC‑LV 带有 GFP标记，将PLVX‑shRNA‑PURO vector环状空质粒，用BamH和EcoR限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX‑SHRNA‑PURO vector酶切片段，连接空PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒pLVX‑CXCR4shRNA；（3）QPCR筛选shRNA：CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，培养293细胞，将获得的质粒pLVX‑CXCR4shRNA和lipo2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细胞的RNA，将RNA反转录为cDNA，利用cDNA为模板，利用所述QPCR引物检测CXCR4基因的相对表达量，荧光定量检测各组引物；PCR反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s。...

【技术特征摘要】
1.CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下：（1）干扰序列设计：根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；（2）慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC-LV 带有 GFP标记，将PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒，用BamH和EcoR 限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段，连接空PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒pLVX-CXCR4shRNA；（3）QPCR筛选shRNA：CXCR4基因的QP...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡志坚，陈愉生，李鸿茹，钟雪晶，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35