CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法技术

本发明专利技术提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，通过根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；然后环状空质粒酶切后，酶切片段连接PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法。
技术介绍
当前在世界范围内肺癌发病率逐年上升，每年大约有超过一百万人死于肺癌，已成为恶性肿瘤最常见死因之一，肺癌约30%患者在病程中出现颅脑转移，脑转移瘤自然生存时间为1～3个月，是恶性肿瘤严重并发症之一，颅脑转移为肺癌死亡的重要原因之一。趋化因子是一类具有生物化学趋化性的细胞因子，其中SDF-1及其特异性受体 CXCR4在肿瘤细胞的迁移与侵袭中发挥了重要的作用。研究显示 SDF-1及其受体CXCR4组成的信号传导通路可能与肺癌的发生、发展及颅脑转移关系密切。在非小细胞肺癌早期诊断和治疗中，侵袭和转移是非小细胞肺癌治疗效果不佳的主要因素。为了更好的研究CXCR4/SDF-1生物学轴在非小细胞肺癌侵袭及转移特别是脑转移中的作用，本研究采用具有脑转移潜能的肺癌细胞PC-9构建细胞模型，通过设计针对CXCR4基因序列的shRNA片段，构建慢病毒shRNA干扰表达载体，从而特异性的靶向沉默肺癌细胞CXCR4基因的表达。慢病毒介导的shRNA干扰的特点是高效、稳定且静默持续时间长，为进一步研究SDF-1/CXC本文档来自技高网...

【技术保护点】
CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下：（1）干扰序列设计：根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；（2）慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC‑LV 带有 GFP标记，将PLVX‑shRNA‑PURO vector环状空质粒，用BamH和EcoR限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX‑SHRNA‑PURO vector酶切片段，连接空PLVX.1载体与shRN...

【技术特征摘要】
1.CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下：（1）干扰序列设计：根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；（2）慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC-LV 带有 GFP标记，将PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒，用BamH和EcoR 限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段，连接空PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒pLVX-CXCR4shRNA；（3）QPCR筛选shRNA：CXCR4基因的QP...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡志坚，陈愉生，李鸿茹，钟雪晶，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35