用于CAR‑T制备的慢病毒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了用于CAR‑T制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法，为临床应用提供了检测标准。本发明专利技术提供的慢病毒载体具有长度小，能够高效表达CAR基因，包装出足够滴度的慢病毒、而且不表达GFP等与治疗无关的标志基因等优点，经实验验证，该慢病毒载体适用于CAR‑T研究和临床应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及慢病毒载体及其制备和应用。
技术介绍
免疫细胞治疗技术是近几年出现的最新的治疗肿瘤的技术，和现有的手术、放疗、化疗、靶向治疗相比，具有自身不可替代的优势和发展潜力，因此，被称为肿瘤治疗的第五大技术。免疫细胞治疗主要包括传统的CIK(Cytokine Induced Killer cells，CIK)、DC-CIK(Dendritic Cells，DC)和最新的CAR-T技术。CAR-T技术，全称为嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T cells，CAR-T)，CAR主要结构包括细胞外结合肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen，TAA)的单链抗体结构域和细胞胞浆内活化T细胞的CD28协同刺激信号和CD3ζ信号，该组合的基因工程设计的序列，克隆入慢病毒载体，包装为慢病毒，感染肿瘤患者的T细胞，就制备成功CAR-T，CAR-T回输肿瘤患者后，T细胞表面的单链抗体识别肿瘤细胞TAA，进而活化T细胞，活化的T细胞杀死识别的肿瘤细胞。CAR-T技术从2011年取得突破性进展以来，在白血病和淋巴本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于CAR‑T制备的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为Pre‑Lenti‑EF1‑MCS，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。

【技术特征摘要】
1.用于CAR-T制备的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为Pre-Lenti-EF1-MCS，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。2.如权利要求1所述的慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：步骤1：基因合成EF1-MCS序列，两端设置ClaI和MluI限制性内切酶位点，所述EF1-MCS序列如SEQ ID 2所示；步骤2：用限制性内切酶Cla I和MluI双酶切pLVX-IRES-Puro载体和所述EF1-MCS序列，分别回收酶切后目的产物；步骤3：连接步骤2回收获得的酶切后目的产物获得慢病毒表达载体Pre-Lenti-EF1-MCS。3.如权利要求1所述慢病毒载体的使用方法，包括下述步骤：步骤1：将目的基因克隆入Pre-Lenti-EF1-MCS载体获得重组慢病毒载体；步骤2：将步骤1获得的重组慢病毒载体和psPAX2和pMD2.0G共同转染宿主细胞；步骤3：培养宿主细胞；步骤4：分离获得重组慢病毒。4.如权利要求3所述慢病毒载体的使用方法，其特征在于，所述宿主细胞为：293或293T细胞。5.一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体由如下方法制备得到：将针对肿瘤相关抗原(TAA)的CAR基因克隆入如权利要求1所述Pre-Lenti-EF1-MCS的多克隆位点处。6.如权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于，其中所述CAR基因识别的肿瘤相关抗原(TAA)选自CD19、CD20、CD22、CD33、CD138、...

【专利技术属性】
技术研发人员：何昱，
申请(专利权)人：北京普瑞金科技有限公司，普瑞金天津生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11