本发明专利技术属于慢病毒载体制备领域，具体涉及一种人WIPI2‑shRNA慢病毒载体、构建方法与应用，合成针对RNA干扰靶点序列的DNA oligo的正链和反链；所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA；通过酶切使慢病毒载体线性化，使线性化载体与步骤（1）得到的双链DNA连接；将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；质粒抽提，用于下一步病毒包装。本发明专利技术构建的人WIPI2‑shRNA慢病毒载体，将载体质粒转染后得到包装并浓缩的病毒，病毒再侵染目的细胞，实现了WIPI2基因干扰，降低WIPI2基因的表达，降低被病毒侵袭的细胞生长速率，提高被病毒侵袭的细胞凋亡率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于慢病毒载体制备领域，具体涉及一种人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建与应用。
技术介绍
WIPI2的全称为WD-repeat protein interacting with phosphoinositides 2，它是WD重复蛋白家族的一个重要的成员，该蛋白家族的共性是具有WD基元，也称为Trp-ASP或WD40，由40个左右氨基酸残基组成，具有保守的GH(glycine-histidine)和WD(tryptophan-aspartic acid)序列，该基元在蛋白质的相互作用方面具有重要作用。目前在跨膜信号转导、物质运输、RNA加工等过程中均起着重要作用。目前研究显示WIPI2与自噬相关，它能够与LC3和PI3P共同作用于自噬小体的形成，并且通过招募自噬相关因子来清除病原体。但是WIPI2与肿瘤的关系未见报道，本专利技术将WIPI2进行干扰后构建慢病毒载体发现能够抑制肝癌细胞的生长，因此具有潜在的治疗肝癌的意义。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的之一是提供一种用于人WIPI2-shRNA慢病毒载体的制备的WIPI2基因的shRNA干扰序列。本专利技术的目的之二是提供人WIPI2-shRNA慢病毒载体。本专利技术的又一个目的是提供人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法。本专利技术的最后一个目的是提供人WIPI2-shRNA慢病毒载体的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：WIPI2基因的shRNA干扰序列，包括DNA oligo的正链和反链，正链序列为5′-CCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3’，反链序列为5’-AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3’；所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA。人WIPI2-shRNA慢病毒载体，由权利要求1所述的双链DNA插入慢病毒载体中制成。所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体针对的RNA干扰靶点序列为：5’-TACGGAAGATGTGTGCATT-3’。人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：(1)合成针对RNA干扰靶点序列的DNA oligo的正链和反链，正链序列为5′-CCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3’，反链序列为5’-AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3’；所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA；(2)通过酶切使载体线性化，使线性化载体与步骤(1)得到的双链DNA连接；(3)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；(4)质粒抽提，用于下一步病毒包装。在步骤(1)中，将合成的DNA oligo的正链和反链的干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链；退火缓冲液含有Tris、EDTA、NaCl。DNA oligo的正链和反链浓度分别为100μM。步骤(2)中，酶切反应温度为37℃，酶切反应中加入AgeI和EcoRI；使线性化载体与步骤(1)得到的双链DNA连接时，于16℃反应1h-3h。步骤(3)中，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞的具体步骤为：将连接产物加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰浴；热激，冰浴；加入无抗生素的LB液体培养基，摇床震荡培养；取菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养；阳性克隆进行PCR鉴定过程中采用的鉴定引物为鉴定引物-F：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’和鉴定引物-R:5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’，具体过程为：挑取单菌落进行PCR扩增，电泳，测序。步骤(4)中，将经PCR鉴定合格的菌液转接培养后，进行质粒抽提；所述的质粒用于转染293T细胞。人WIPI2-shRNA慢病毒载体在制备shRNA慢病毒以及作为制备降低WIPI2基因的表达、降低被病毒侵袭的细胞生长速率或提高被病毒侵袭的细胞凋亡率的试剂中的应用。人WIPI2-shRNA慢病毒载体在制备降低被病毒侵袭的肝癌细胞生长速率的试剂中的应用。本专利技术构建的人WIPI2-shRNA慢病毒载体，将载体质粒转染后得到包装并浓缩的病毒，病毒再侵染目的细胞，实现了WIPI2基因干扰，降低WIPI2基因的表达，降低被病毒侵袭的细胞生长速率，提高被病毒侵袭的细胞凋亡率。附图说明图1为GV115载体图谱；图2为线性化载体的琼脂糖凝胶电泳图片；图3为PCR产物琼脂糖凝胶电泳图片；图4为病毒感染细胞后GFP表达情况示意图；图5为WB验证目的基因干扰有效性的结果示意图；图6为各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平示意图；图7为MTT检测WIPI2基因干扰后对细胞生长的影响结果示意图；图8和图9为流式细胞仪检测WIPI2基因干扰后细胞凋亡情况示意图；图10和图11为WIPI2基因干扰后影响肝癌细胞增殖情况示意图。具体实施方式以下将结合附图和实施例详细地说明本专利技术所涉及实施例的技术方案。一、实验材料1.实验质粒本次实验使用GV115载体，购自上海吉凯基因化学技术有限公司,载体图谱如图1。2.实验菌株TOP10大肠杆菌感受态细胞(TIANGEN,Cat.#CB104-03)3.实验试剂3.1酶类试剂表1酶类试剂组成3.2其他试剂表2其它试剂3.3实验仪器表3实验仪器4.实验试剂的配制4.1退火缓冲液(pH＝7.5-8.0)表4退火缓冲液组成4.2 LB液体培养基(100ml，pH＝7.0)表5 LB液体培养基组成含氨苄青霉素的LB培养基中氨苄青霉素的含量为100μg/ml。4.3 LB固体培养基(100ml，pH＝7.0)表6 LB固体培养基组成含氨苄青霉素的LB培养基中氨苄青霉素的含量为100μg/ml。二、实验方法(一)RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备1.基因信息表7基因信息2.RNA干扰靶点设计根据RNA干扰序列设计原则，以WIPI2基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。表8 RNA干扰靶点设计3.DNA oligo序列合成根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。＊CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G：EcoRI酶切位点互补序列。表9 DNA oligo正反向序列4.双链DNA oligo制备将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度100μM)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。终浓度指DNAligo干粉溶解在退火缓冲液中的浓度为100μM。(二)线性化载体制备按照NEB说明书配制50μl反应体系，使用AgeI和EcoRI双本文档来自技高网...
【技术保护点】
WIPI2基因的shRNA干扰序列，包括DNA oligo的正链和反链，正链序列为5‘‑CCGGGATACG GAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG‑3’，反链序列为5’‑AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC‑3’；所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA。
【技术特征摘要】
1.WIPI2基因的shRNA干扰序列，包括DNA oligo的正链和反链，正链序列为5‘-CCGGGATACG GAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3’，反链序列为5’-AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3’；所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA。2.人WIPI2-shRNA慢病毒载体，由权利要求1所述的双链DNA插入慢病毒载体中制成。3.根据权利要求2所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体，其特征在于，所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体针对的RNA干扰靶点序列为：5’-TACGGAAGATGTGTGCATT-3’。4.人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：（1）合成针对RNA干扰靶点序列的DNA oligo的正链和反链，正链序列为5‘-CCGGGATACG GAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3’，反链序列为5’-AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAAT GCACACATCTTCCGTATC-3’；所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA；（2）通过酶切使载体线性化，使线性化载体与步骤（1）得到的双链DNA连接；（3）将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；（4）质粒抽提，用于下一步病毒包装。5.根据权利要求4所述的人...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁献温，丁义涛，孙喜太，施晓雷，
申请(专利权)人：南京大学医学院附属鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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