本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种病毒载体颗粒及其构建方法和在治疗人类慢性疼痛药物中的应用。该病毒载体颗粒包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素酶活区以及内部核糖体进入位点序列。该病毒载体颗粒的构建方法包括（1）细胞系 lenti-x293T的培养；（2）换成DMEM培养基；（3）将pspax2、pmd2.G和pwpi质粒转染到lenti-x293T细胞；（4）洗掉转染液，加入含10wt%小牛血清的培养液进行培养；（5）回收培养液，过滤、离心，即可获得高滴度的病毒载体颗粒。本发明专利技术病毒载体颗粒对治疗慢性疼痛更有针对性，可以阻止神经系统和外周细胞之间的恶性循环。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种病毒载体颗粒及其构建方法和在治 疗人类慢性疼痛药物中的应用。
技术介绍
疼痛是对于实际的或潜在的损害产生的一种不愉快的感觉和情感体验，是一个复 杂的感性经验，包括传达感官信息的nociceptors(疼痛感受器)对于如位置、类型和强度的 刺激产生的反应。一直以来疼痛及其治疗被视为重要和有趣的医学领域。 慢性疼痛是组织所造成的伤害，很多时候伴有神经的长期损伤。慢性疼痛是由于 激活了nociceptors (疼痛接收器）导致nociception (神经处理有害刺激），疼痛的感觉 开始于神经传入。中枢系统也发挥了作用，从而维持疼痛的持久性。 神经和免疫系统是链接外围炎症反应之间的一个重要环节。细胞因子在没有人身 伤害或损坏的情况下可以触发疼痛，促进炎症，细胞因子的产生水平升高在大脑和脊髓的 外围神经系统（感官神经细胞）造成损害。在外周神经受到伤害后，免疫反应在背根 Ganglia (DRGs)由macrophages(巨细胞）、淋巴细胞和卫星细胞产生。因痛觉感受神经 元释放痛觉递质（P物质、CGRP和激素产生的基因相关肽）从而刺激免疫细胞，如 macrophages (巨细胞）、synoviocytes (滑膜细胞)导致分泌炎性细胞因子，如TNF-α和IL-6 〇另一方面，neurodegeneration(神经退行性变)造成痛觉多肽P物质和降|丐素 CGRP等刺激 免疫细胞释放细胞因子。总之，神经系统和外周炎症细胞建立了一个恶性循环的过程。 目前治疗急性和慢性疼痛依靠三大类的止痛药物nonsteroidal抗炎药物 (NSAIDs )、阿片类药物和ad juvants (抗抑郁药、抗痉挛药、当地麻醉气体、2-adrenoceptor「 一种促效剂」hNSAIDs和阿片类药物过度使用会产生副作用（恶心、呕吐、胃粘膜溃疡、肾 功能衰竭、肝功能衰竭、呼吸抑制、咳嗽抑制等），甚至涉及神经伤害。所以通常需要进行剂 量滴定直到足够剂量但又不会产生疼痛或不可容忍的副作用。令人遗憾的是，第二种结果 常常发生所以必须终止治疗，结果是只有部分程度的疼痛能被消除。 近年来，由于肉毒素的特异性切割SNARE蛋白并抑制过度的痛觉和炎症因子分泌， 已成功应用到治疗疾病。根据肉毒素的血清型共分为7类，A-G，每一类都拥有独一无二的特 点，它们会选择性地切割各自的SNARE蛋白底物，比如SNAP-25(突触小体相关蛋白）能被肉 毒素 A/C1/E型所切割、syntaxinl (突触融合蛋白）被肉毒素 C1型、synaptobrevin(小突触泡 蛋白）能被肉毒素 B/D/F和/G型所切割(表1)。 表1肉毒素的血清型和切割位点目前，小剂量的肉毒素已被成功用作化妆品和骨关节肌肉病治疗，其持续作用时间较 长(6个月以上），副作用小。近年来临床上又被用于偏头痛/张力头痛和肌肉疼痛综合症软 组织疼痛的综合症等，注射3个月的患者还仍能起到镇痛作用。 肉毒素的经典作用机理是抑制肌肉运动的神经递质（乙酰胆碱，acetylcholine) 的分泌从而导致肌肉瘫痪，临床上用作治疗肌肉过度紧张。神经递质的释放是一个多阶段 过程，包括突触小泡和等离子膜之间的融合，从而建立一个通道，致使突触小泡中的分泌物 释放到细胞外。在神经细胞分泌中，小突触泡蛋白的C-端位于突触小泡泡膜，突触融合蛋 白和通过几个半胱氨酸-链接棕榈酰链位于细胞膜的SNAP-25会形成蛋白复合体。这种复 合体新的形成还需要大量涌入的Ca2+激活钙传感器突触结合蛋白。这一复合体介导突触 小泡和细胞膜的融合从而小泡内的神经递质或细胞因子被释放到细胞外。 最近几年来，肉毒素也被用作治疗长期疼痛的制剂。因为科学家们发现它们也能 抑制痛觉神经递质的传导，比如CGRP和SP。风湿病专家发现肉毒素不仅治疗紧张头痛/偏 头痛，在RA(类风湿性关节炎)和0A(骨关节炎)患者中对其他药品效果不佳的病人注射这种 毒素到关节也能很有效的去除疼痛和发炎，但是，由于关节内膜细胞和巨噬细胞对毒素不 敏感，不具有毒素作用的细胞受体，所以不能很好的抑制炎症因子和炎症因子对感官神经 细胞的刺激，所以感觉神经元仍能分泌痛觉递质。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种病毒载体颗粒，对治疗慢性疼痛更有针对性，可以 阻止神经系统和外周细胞之间的恶性循环。可广泛应用于治疗人类慢性疼痛的药物，尤其 用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎的药物。为解决以上问题，本专利技术通过以下技术方案实现： 设-Η种病毒载体颗粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，所述pwpi质粒包含启动子、 肉毒素酶活区以及内部核糖体进入位点（IRES)序列。 优选的，所述肉毒素酶活区为A型、B型、C型或D型。 优选的，所述病毒为慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒中的一种。 优选的，所述D型肉毒素酶活区序列的起始编码序列之前插入有增强表达序列 ACCATGGGC〇 上述病毒载体颗粒的构建方法，包括以下步骤： (1)将细胞系lenti-x293T的细胞密度培养至70%; (2) 洗去培养液中的血清，换成无血清的DMEM培养基； (3) 将pspax2、pmd2.G和pwpi质粒用磷酸|丐转染法转染到lenti-x293T细胞中； (4) 四小时后，洗掉转染液，加入含10wt%小牛血清的培养液进行培养； (5) 回收培养液，将细胞碎片过滤，再进行超速离心，即可获得高滴度的病毒载体颗粒。 优选的，步骤⑶所述pwpi、pmd2.G和pspax2的转染用量比例为2:1:10。 优选的，步骤(3)所述转染方法具体包括以下步骤： ①在10mL的Falcon管A中加入288yL 2mol/L的CaCl2溶液，以及pwpi质粒10yg、 pmd2.G质粒5yg和pspax2质粒100yg，补水到2880yL的总体积； '②在10mL的Falcon管B中加入2880yL的2xHBS buffer，再将Falcon管A中液体滴入 Falcon管B，在2~3秒内迅速混合均勾； ⑩将所得混合液在室温下放置15~20分钟，再滴入长有lenti-x293T细胞的直径为 15cm的培养皿中。 优选的，将所述所述细胞碎片通过0.45微米过滤器进行过滤;所述超速离心的转 速为30000rpm，时间为2h。 本专利技术具有以下积极有益效果： 专利技术人以膝关节病发时起关键作用的人类关节滑膜细胞、巨噬细胞和感官神经细胞为 研究对象，这些细胞在痛觉和炎症发生时过多的分泌细胞因子或神经多肽，而这些与痛觉 和炎症相关的因子需要SNARE蛋白的介导才能分泌。 (1)本专利技术有针对性的在神经和非神经元细胞进行基因水平的治疗，利用病毒靶 向性介导肉毒素的蛋白酶活力到特异细胞，从而切割SNARE蛋白，以控制炎症因子的分泌， 实验结果显示肉毒素蛋白酶成功作用，在巨噬细胞、关节滑膜细胞中阻断释放细胞因子 (TNF-α和IL6)。这对于现有的镇痛和抗炎药物研究有开创性的作用。 (2)由于关节炎和慢性头疼的发生系统涉及到神经和其外周非神经系统，痛觉和 炎症因子过度分泌，两种系统之间的恶性循环和相互作用，只针对其中一种系统的肉毒素 的治疗已现不足，所以本专利技术利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种病毒载体颗粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，其特征在于：所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素酶活区以及内部核糖体进入位点序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟疆辉，
申请(专利权)人：郑州可尔利尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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