嵌合腺相关病毒/博卡病毒细小病毒载体制造技术

本发明专利技术提供经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒(bocavirus)衣壳蛋白质和重组型腺相关病毒(AAV)基因体；经分离的rBoV，其包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和重组型BoV基因体，以及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合腺相关病毒/博卡病毒细小病毒载体相关申请的交叉引用本申请案要求2013年4月8日提交的美国申请案第61/809,702号的申请日的权利，其公开内容并入本文中。政府权利的声明本专利技术是在政府支持下，在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的HL108902下进行。政府对本专利技术拥有一定的权利。
技术介绍
基因疗法自1990年以来已广泛用于临床试验，其中报导多个使用病毒或非病毒载体传递治疗基因的成功案例。肺对于具有固有基因缺陷(如囊肿性纤维化(CF)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)不足)或其它慢性后天性呼吸道病症(如哮喘和肺癌)的患者的基因疗法治疗来说是重要器官。其中，由编码蛋白质囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)的单基因缺陷引起的肺病CF是最常见的危及生命的基因缺陷固有疾病，其仅在美国每年便花费约45000万美元用于患者护理。尽管近十年来，临床治疗具有改良的CF患者生活质量和寿命，但对于这种单基因缺陷固有疾病，基因疗法通过置换缺陷性CFTR基因以永久地矫正病症来呈现最佳治愈(米勒(Mueller)等人,2008；德瑞斯科尔(Driskell)等人,2003；格里森巴赫(Griesenbach)等人,2010)。CF是由CFTR基因编码中的突变引起的常染色体隐性基因病症(罗门斯(Rommens)等人,1989)。其是多器官疾病，但CF肺病是最能危及生命的(罗伊(Rowe)等人,2005)。重组型腺相关病毒载体(rAAV)是当前研究用于CF肺基因疗法的一种基因疗法药剂(格里森巴赫等人,2010；弗洛狄(Flotte),2007；卡特(Carter),2005)。用于CF肺基因疗法的rAAV载体已研究接近二十年，并且大部分血清型似乎由呼吸道上皮细胞的顶端表面内吞而与转导(即经编码的转基因的表达)的变化程度无关。尽管这些载体在参看临床试验中显示良好的安全性概况(艾特肯(Aitken)等人,2001；莫斯(Moss)等人,2007；瓦格纳(Wagner)等人,2002)，但其由于两个重要原因而未能实现体内互补。首先，感染之后的病毒粒子处理中的进入后障壁似乎以蛋白酶体依赖性方式限制细胞核易位，并且因此限制转基因表达(段(Duan)等人,2000；丁(Ding)等人,2005；颜(Yan)等人,2002；钟(Zhong)等人,2008；钟等人,2007)。rAAV2的这一特征反映在CF临床试验中，其中病毒基因组留存在测试个体的呼吸道上皮细胞中并且未检测到转基因衍生的CFTRmRNA或肺功能的临床改良(艾特肯等人,2001；莫斯等人,2007；瓦格纳等人,2002)。由于动物模型与人类之间的物种特异性差异，已证明鉴别可避免这些局限性的适合的rAAV血清型具有挑战性(弗洛狄等人,2010；刘(Liu)等人,2007a；刘等人,2007b)。已证明rAAV1是用于人类呼吸道顶端感染的最有效血清型(弗洛狄等人,2010；颜等人,2012；颜等人,2006)，而其它人在使用引导型衣壳进化以增强顶端人类上皮(HAE)转导中rAAV的向性方面取得成功(李(Li)等人,2009；埃克斯科丰(Excoffon)等人,2009)。然而，CFHAE中的有效CFTR互补仍需要使用蛋白酶体抑制剂以增强转导(李等人,2009；张等人,2004)。来自rAAV载体的有效CFTR表达的第二个主要障碍是其有限的封装能力(约4.9kb)，其必须使用小型弱启动子和/或使用CFTR小基因(张等人,1998)。临床试验中测试的第一代rAAV-CFTR使用AAV2ITR内的隐藏启动子驱动全长CFTRcDNA的表达(艾特肯等人,2001)，并且这随后通过并入短83bp合成启动子得到改良(张等人,2004)。其它避开rAAV载体的小填充能力的努力包括通过删除非关键序列(如R结构域处的部分缺失)以扩展核心启动子元件(如缩短的CMV启动子)的空间来削减CFTRcDNA的尺寸(李等人,2009；张等人,1998；奥斯特加德(Ostedgaard)等人,2005；奥斯特加德等人,2002)。尽管这些策略具有改良的CFTR表达，但显而易见的是，推动rAAV的封装限制可引起rAAV基因体的5'端处的不一致缺失(卡普拉诺夫(Kapranov)等人,2012)，因此进一步损害基因体稳定性和表达。
技术实现思路
如本文中所述，重组型人类博卡病毒-1(HBoV-1)是由ORF破坏的rHBoV1基因体产生，其从顶端表面有效转导人类呼吸道上皮(HAE)。HBoV1的较大基因体和高呼吸道向性对于产生用于基因转移(例如呼吸道基因转移)的病毒载体来说是理想的，包括用于遗传性和后天性疾病的基因疗法，如遗传性和后天性肺部疾病、癌症，以及例如针对呼吸道疾病的疫苗。如本文中进一步描述，产生rAAV2/HBoV1嵌合病毒(例如约5.5kb基因体)，其中HBoV1衣壳封装尺寸过大的rAAV2基因组。临床试验支持在用于囊肿性纤维化(参看)肺病的基因疗法情形下应用rAAV2基因体的安全性。嵌合载体保持rAAV2基因体的高安全性概况，同时还提供HBoV1衣壳的呼吸道顶端向性。已证实rAAV2/HBoV1能够以比rAAV1或rAAV2(4.7kb基因组)分别大5.6倍和70倍的功效顶端转导HAE。分子研究表明HBoV1衣壳介导的基因转移需要呼吸道上皮细胞的极化。此外，含有全长CFTR编码序列和强CBA启动子的rAAV2/HBoV1-CFTR病毒可有效矫正囊肿性纤维化HAE中的CFTR依赖性氯离子传递。因此，嵌合AAV/HBoV病毒载体适用于囊肿性纤维化和其它肺部疾病的基因疗法，以及研发针对HBoV1感染和其它呼吸道病毒(如流感病毒)的疫苗。在感染期期间的蛋白酶体抑制剂的共同投药还使AAV/HBoV1嵌合载体转导显著增强一千倍。因此，本专利技术提供基因转移载体，例如用于人类肺疾病基因疗法和疫苗。载体对人类呼吸道具有高向性，具有HBoV衣壳之大封装能力并且使rAAV基因体有效衣壳化。作为高效呼吸道转导载体，载体可用于CF基因疗法策略，以及用于其它肺部疾病的基因疗法，如AAT不足、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、肺癌以及针对野生型HBoV感染和其它呼吸道感染(如流感病毒和呼吸道合胞体病毒(RSV)感染)的疫苗接种，例如在婴儿、幼童、青少年或成年人中。本专利技术还提供用于研发具有rAAV基因组的基于博卡病毒(BoV)的基因转移疫苗的平台，其用于人类、宠物和家畜，包括(但不限于)肺部疾病。基因转移载体的博卡病毒衣壳(例如重组型博卡病毒载体(rBoV)和嵌合腺相关/博卡病毒细小病毒载体(rAAV/BoV))可来自人类博卡病毒和非人类博卡病毒的不同染色。人类博卡病毒1(HBoV1)是具有感染呼吸道的向性的呼吸性病毒，并且人类博卡病毒2到博卡病毒4(HBoV2、HBoV3和HBoV4)是具有感染胃肠道的向性的肠病毒。已从非人类哺乳动物分离非人类博卡病毒，如猪博卡病毒、犬博卡病毒和猫博卡病毒。在一个实施例中，本专利技术提供经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒衣壳蛋白质(例如人类博卡病毒衣壳蛋白质)和重组型异源细小病毒基因体(例如重组型腺相关病毒(AAV)基因体)。举例来说，rAAV基因体可包括编码异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒衣壳蛋白质和重组型腺相关病毒AAV基因体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.08 US 61/809,7021.一种经分离的嵌合病毒，其包含人类博卡病毒HBoV衣壳蛋白质和重组型腺相关病毒rAAV基因组。2.根据权利要求1所述的病毒，其中所述基因组包含编码异源基因产物的表达卡匣。3.根据权利要求2所述的病毒，其中所述基因产物编码治疗性或预防性蛋白质。4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的病毒，其中所述rAAV基因组是rAAV-1、rAAV-2、rAAV-3、rAAV-4、rAAV-5、rAAV-6、rAAV-7、rAAV-8或rAAV-9基因组。5.根据权利要求2或3所述的病毒，其中所述基因产物是病毒蛋白质、细菌蛋白质、肿瘤蛋白质、寄生虫蛋白质或真菌蛋白质。6.根据权利要求2或3所述的病毒，其中所述基因产物是囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白、α1-抗胰蛋白酶、表面活性剂蛋白质SP-D、SP-A或SP-C、红血球生成素、HBoV蛋白质、流感病毒蛋白质、RSV蛋白质、中和型抗体或其抗原结合片段、SARS病毒蛋白质或细胞激素。7.一种在哺乳动物细胞中表达异源基因产物的体外方法，其包含提供根据权利要求2到6中任一权利要求所述的病毒；和利用有效表达所述异源基因产物的量的所述病毒感染所述细胞。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述基因产物是治疗性基因产物或预防性基因产物。9.一种增强哺乳动物细胞的嵌合病毒转导的体外方法，其包含：使哺乳动物细胞与经分离的嵌合病毒和有效地加性地或协同地增强rAAV转导的量的至少一种药剂接触，所述经分离的嵌合病毒包含人类博卡病毒HBoV衣壳蛋白质和包含编码异源基因产物的转基因的rAAV基因组。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物鼻上皮细胞、气管支气管细胞或肺细胞。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述药剂是蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂。12.一种包含人类博卡病毒HBoV衣壳蛋白质和rAAV基因组的经分离的嵌合病毒在制备药物中的用途，所述药物用于抑制或治疗哺乳动物的与内源性基因产物的异常表达相关的病状，其中所述rAAV基因组包含编码至少一部分功能性基因产物的转基因，所述功能性基因产物于所述哺乳动物中的表达抑制或治疗所述病状的至少一种症状。13.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述转基因编码囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、α-抗胰蛋白酶、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白或红血球生成素。14.根据权利要求12所述的用途，其中所述哺乳动物进一步与促进转导的量的至少一种蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂接触。15.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种药剂是LLnL、Z-LLL、硼替佐米、埃普霉素、多柔比星、多希、道诺霉素、艾达霉素、表柔比星、阿克拉霉素、辛伐他汀、鞣酸、喜树碱或顺铂。16.一种包含人类博卡病毒HBoV衣壳蛋白质和rAAV基因组的嵌合病毒在制备药物中的用途，所述药物用于增强哺乳动物细胞的病毒转导的方法中，其中所述方法包含将哺乳动物细胞与所述药物以及有效促进哺乳动物细胞转导的量的药剂接触，所述促进是相对于未与所述药剂接触的哺乳动物细胞来说，其中所述药剂是蛋白酶体抑制剂。17.一种嵌合病毒在制备药...

【专利技术属性】
技术研发人员：严子英，约翰·F·恩格尔哈特，邱建明，
申请(专利权)人：爱荷华大学研究基金会，堪萨斯州立大学，
类型：发明
国别省市：美国;US