本发明专利技术涉及CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途。本发明专利技术人通过缩小优化Cas9表达元件，制备了具有组织细胞广谱表达的Cas9蛋白的AAV表达载体，首次实现将整个表达元件和Cas9编码序列包装进AAV病毒。基于AAV病毒包装的特性，只需更换包装衣壳质粒，即可将此Cas9载体包装成不同血清型的AAV病毒。本发明专利技术获得的病毒可以有效地实现组织靶向表达及DNA编辑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因
，更具体地，本专利技术涉及CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途。
技术介绍
II型原核CRISPR/Cas系统是细菌的一种获得性免疫系统，能够降解噬菌体DNA或外源质粒。经过改造的人工内切核酸酶CRISPR/Cas9，由Cas9蛋白，含有引导序列的crRNA和tracrRNA组成。通过20碱基的引导序列和目的DNA互补配对结合，Cas9在靶DNA进行切割产生双键断裂。DNA双链断裂通过高保真的同源重组或者容易引入插入/缺失突变的非同源末端连接途径进行修复。通过同源重组途径修复时，在同源模板存在情况下，将会按照模板进行定向修复。非同源末端连接途径则会导致移码突变，破坏读码框并扰乱蛋白的表达。目前这一技术被广泛应用于各种基因型细胞及小鼠模型的制备，并可同时高效地获取多位点突变，极大地缩短实验时间。此外，在细胞水平及小鼠水平的疾病模型中，此系统能够有效地修复致病的基因突变，从根本上治疗遗传病。但是目前这一系统局限于受精卵及肝脏中，其他器官的靶向递送尚待解决。目前有慢病毒和腺病毒载体被用于递送CRISPR/Cas9系统。但是，慢病毒会插入基因组造成插入突变；而腺病毒为5型腺病毒，其嗜肝，在其他组织的表达非常少。综上，本领域迫切需要进一步优化递送CRISPR/Cas9系统，以期能够在其它器官或组织中实现基因靶向操作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体
构建及其用途。在本专利技术的第一方面，提供一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体，该载体包括如下操作性连接的序列元件(按照5’→3’的方向)：5’末端反向重复序列(即L-ITR)，CMV启动子序列，核定位信号1序列，Cas9编码核酸序列，核定位信号2序列，miniPolyA序列和3’末端反向重复序列。在一个优选例中，所述的重组腺相关病毒载体中，所述的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第1～141位所示；所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO:1中第165～828位所示；所述的核定位信号1序列如SEQ ID NO:1中第913～963位所示；所述的Cas9编码核酸序列如SEQ ID NO:1中第964～5064位所示；所述的核定位信号2序列如SEQ ID NO:1中第5065～5112位所示；所述的miniPolyA序列如SEQ ID NO:1中第5122～5169位所示；所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第5192～5332位所示。在另一优选例中，所述的重组腺相关病毒载体中，在核定位信号1序列的5’端或核定位信号2序列的3’端，还包括标签序列。在另一优选例中，所述的标签是Flag，较佳地为3×Flag标签。在本专利技术的另一方面，提供所述的重组腺相关病毒载体的用途，用于制备病毒，所述的病毒能够在特定组织(如心脏)中表达Cas9蛋白。在本专利技术的另一方面，提供一种重组腺相关病毒，所述病毒由所述的重组腺相关病毒载体包装获得。在本专利技术的另一方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒中包括：所述的重组腺相关病毒；或所述的重组腺相关病毒载体。在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：所述的表达Cas9的重组腺相关病毒载体。在另一优选例中，其中还包括能在体内形成sgRNA(single-guided RNA)和TracrRNA(Trans-activating crRNA)的载体或由该载体包装成的腺相关病毒。在另一优选例中，所述的在体内形成sgRNA和TracrRNA的载体包括如下操作性连接的序列元件(按照5’→3’的方向)：缺失D序列的5’末端反向重复序列，sgRNA和TracrRNA的表达盒，和3’末端反向重复序列。在另一优选例中，所述的sgRNA和TracrRNA序列的表达盒包括：U6启动子序列，sgRNA和TracrRNA序列，U6终止子序列。在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的缺失D序列的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:2中第1～117位所示；所述的U6启动子序列如SEQ ID NO:2中第141～389位所示；所述的sgRNA和TracrRNA序列如SEQ ID NO:2中第408～483位所示；所述的U6终止子序列如SEQ ID NO:2中第484～489位所示；或所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:2中第2108～2248位所示。在另一优选例中，所述的sgRNA和TracrRNA序列的表达盒与3’末端反向重复序列之间，还包括报告基因的表达盒。在另一优选例中，所述的报告基因的表达盒包括：PGK启动子，EGFP编码核酸以及SV40polyA。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1A、AAV-Cas9表达质粒的图谱，该质粒表达带有3xFlag标签的Cas9蛋白。Cas9的完整表达元件依次为CMV启动子，带有3×Flag标签及两端核定位信号NLS的Cas9读码框，人工微小加尾信号miniPolyA。总大小为5.0kb。图1B、AAV-sgRNA表达质粒的图谱，该质粒表达融合了引导RNA和TracrRNA的融合RNA。该载体的5’端ITR删除了D序列(Δ-ITR)，将包装成双链AAV病毒。该载体中构建了小鼠PGK启动子驱动的EGFP蛋白表达元件，用以方便检测病毒感染表达分布。图2、AAV9-Cas9注射小鼠左心室1个月后，利用抗Flag标签的抗体通过Western Blot检测Cas9蛋白在小鼠各组织的表达状况。图3A、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1个月后，小鼠心肌
靶点DNA测序图。图3B、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1个月后，小鼠心肌靶DNA位点的测序结果，显示发生随机插入/缺失突变。图3C、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1个月后，通过Surveyor酶检测小鼠心肌靶点DNA发生突变的比例。图4、pAAV-MCS的质粒图谱。图5、pX330的质粒图谱。图6、AAV-Cas9的质粒图谱。图7、pscAAV-U6-BB-chemeric_sgRNA的质粒图谱。图8、scAAV-sgRNA的质粒图谱。具体实施方式本专利技术人经过深入的研究，通过缩小优化Cas9表达元件，制备了具有组织细胞广谱表达的Cas9蛋白的AAV表达载体，首次实现将整个表达元件和Cas9编码序列包装进AAV病毒。基于AAV病毒包装的特性，只需更换包装衣壳质粒，即可将此Cas9载体包装成不同血清型的AAV病毒。本专利技术获得的病毒可以有效地实现特定组织(如心脏)的靶向表达及目的DNA编辑。术语如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本专利技术中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本专利技术中所提供的那些，也本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体，其特征在于，该载体包括如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列，CMV启动子序列，核定位信号1序列，Cas9编码核酸序列，核定位信号2序列，miniPolyA序列和3’末端反向重复序列。
【技术特征摘要】
1.一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体，其特征在于，该载体包括如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列，CMV启动子序列，核定位信号1序列，Cas9编码核酸序列，核定位信号2序列，miniPolyA序列和3’末端反向重复序列。2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第1～141位所示；所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO:1中第165～828位所示；所述的核定位信号1序列如SEQ ID NO:1中第913～963位所示；所述的Cas9编码核酸序列如SEQ ID NO:1中第964～5064位所示；所述的核定位信号2序列如SEQ ID NO:1中第5065～5112位所示；所述的miniPolyA序列如SEQ ID NO:1中第5122～5169位所示；所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第5192～5332位所示。3.如权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，在核定位信号1序列的5’端或核定位信号2序列的3’端，还包括标签序列。4.权利要求1所述的重组腺相关病毒载体的用途，用于制备病毒，所述的病毒能够在特定组织中表达Cas9蛋白。5.一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述病毒由权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体包装获得。6...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋保亮，谢畅，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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