CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途制造技术

本发明专利技术涉及CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途。本发明专利技术人通过缩小优化Cas9表达元件，制备了具有组织细胞广谱表达的Cas9蛋白的AAV表达载体，首次实现将整个表达元件和Cas9编码序列包装进AAV病毒。基于AAV病毒包装的特性，只需更换包装衣壳质粒，即可将此Cas9载体包装成不同血清型的AAV病毒。本发明专利技术获得的病毒可以有效地实现组织靶向表达及DNA编辑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因
，更具体地，本专利技术涉及CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途。
技术介绍
II型原核CRISPR/Cas系统是细菌的一种获得性免疫系统，能够降解噬菌体DNA或外源质粒。经过改造的人工内切核酸酶CRISPR/Cas9，由Cas9蛋白，含有引导序列的crRNA和tracrRNA组成。通过20碱基的引导序列和目的DNA互补配对结合，Cas9在靶DNA进行切割产生双键断裂。DNA双链断裂通过高保真的同源重组或者容易引入插入/缺失突变的非同源末端连接途径进行修复。通过同源重组途径修复时，在同源模板存在情况下，将会按照模板进行定向修复。非同源末端连接途径则会导致移码突变，破坏读码框并扰乱蛋白的表达。目前这一技术被广泛应用于各种基因型细胞及小鼠模型的制备，并可同时高效地获取多位点突变，极大地缩短实验时间。此外，在细胞水平及小鼠水平的疾病模型中，此系统能够有效地修复致病的基因突变，从根本上治疗遗传病。但是目前这一系统局限于受精卵及肝脏中，其他器官的靶向递送尚待解决。目前有慢病毒和腺病毒载体被用于递送CRISPR/Cas9系统。但是，慢病毒会插本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体，其特征在于，该载体包括如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列，CMV启动子序列，核定位信号1序列，Cas9编码核酸序列，核定位信号2序列，miniPolyA序列和3’末端反向重复序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体，其特征在于，该载体包括如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列，CMV启动子序列，核定位信号1序列，Cas9编码核酸序列，核定位信号2序列，miniPolyA序列和3’末端反向重复序列。2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第1～141位所示；所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO:1中第165～828位所示；所述的核定位信号1序列如SEQ ID NO:1中第913～963位所示；所述的Cas9编码核酸序列如SEQ ID NO:1中第964～5064位所示；所述的核定位信号2序列如SEQ ID NO:1中第5065～5112位所示；所述的miniPolyA序列如SEQ ID NO:1中第5122～5169位所示；所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第5192～5332位所示。3.如权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，在核定位信号1序列的5’端或核定位信号2序列的3’端，还包括标签序列。4.权利要求1所述的重组腺相关病毒载体的用途，用于制备病毒，所述的病毒能够在特定组织中表达Cas9蛋白。5.一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述病毒由权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体包装获得。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋保亮，谢畅，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31