一种慢病毒干扰载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种慢病毒干扰载体及其构建方法和应用，成功构建了靶向ZNF185的shRNA，针对小鼠ZNF185基因的mRNA序列设计合成shRNA，该shRNA不会损伤小鼠睾丸间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌，为人类避孕研究提供新的靶点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种shRNA及其构建和应用，具体地说是一种靶向ZNF185的慢病毒干扰载体及其构建方法和应用，属于分子生物学及生物医学领域。
技术介绍
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是真核生物中高度保守的，由小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）介导的转录后基因沉默现象，在基因的功能研究中得到了广泛应用，并有望在疾病治疗中发挥重要的作用。锌指蛋白(zinc finger protein, ZNF)185是一种LIM蛋白。1997年，Heiss等人应用外显子捕获的方法，首先发现了ZNF185基因。后续的研究发现，ZNF185是一种特殊的锌指蛋白基因，在生物体的生长、发育、分化、肿瘤发生等过程中发挥重要的功能。研究发现ZNF185在小鼠睾丸组织中的表达显著高于其它组织，特别在睾丸间质细胞和精子中呈高表达。睾丸间质细胞是构成睾丸组织的重要细胞，在曲细精管周围的结缔组织中广为分布，其主要功能是分泌雄性激素和细胞因子，其中男性体内大约95%的睾酮均由间质细胞合成并分泌。研究表明，睾酮在人类精子发生、性分化调控、维持性功能与促进附属性腺发育等过程中发挥重要的作用。因此，ZNF185可能与睾丸间质细胞的睾酮分泌合成功能密切相关，进而调控精子的生成，而目前关于ZNF185在睾丸间质细胞睾酮分泌功能方面的研究尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，设计了一种靶向ZNF185的慢病毒干扰载体及其构建方法和应用，针对小鼠ZNF185基因的mRNA序列设计合成shRNA，该shRNA不会损伤小鼠睾丸间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌，为人类避孕研究提供新的靶点。本专利技术的技术方案为：本专利技术针对与精子发生密切相关的重要基因ZNF185，设计并构建了一种shRNA，该shRNA能显著降低小鼠睾丸间质细胞中ZNF185的蛋白表达水平，同时不会损伤小鼠间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌。一种慢病毒干扰载体，所述载体含有小鼠的ZNF185基因干扰片段，所述慢病毒载体的shRNA序列是：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′。所述慢病毒转染小鼠睾丸间质细胞后，能显著敲低ZNF185蛋白的表达，细胞增殖能力未发生明显变化，睾酮分泌能力显著降低。一种上述靶向ZNF185的慢病毒干扰载体的构建方法，包括以下步骤：（一）ZNF185干扰载体的构建首先针对小鼠ZNF185基因（Gene ID: 22673）设计一套干扰序列，并合成miRNA oligos，退火后序列亚克隆到pcDNA6.2™-GW/ EmGFP-miR载体中，测序验证；具体过程如下：1、Oligo DNA的设计与合成针对ZNF185基因序列，通过BLOCK-iT™ RNAi Express数据库提交基因信息选择干扰位点，设计互补的Oligo DNA，正义链的5′端添加了TGCT，反义链的5′端添加了CCTG。其正义链与反义链序列分别为：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′；阴性对照的正义链与反义链序列分别为：F:5′-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3′；R:5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTT-3′；2、miRNA载体的构建与验证将上述步骤1合成好的Oligo DNA经退火后合成双链DNA，然后连接到pcDNA6.2™-GW/ EmGFP-miR载体中，将连接产物转化感受态细胞DH5α，最后挑取克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，得到阳性的克隆和质粒；（二）ZNF185慢病毒载体构建将上述步骤（一）构建的miRNA干扰载体经单酶切后纯化；然后将线性化的干扰质粒与pDONR221载体进行BP重组反应，以获得含干扰序列的入门载体；然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒目的载体pLenti6.3/V5-dest进行LR重组反应，以获得含干扰序列的慢病毒表达载体；具体过程如下：1、干扰质粒线性化1.1 配制30ul单酶切体系如下：Sterile water10.5ul10x buffer (NEB buffer 3)3.0ulEag I1.5ul干扰质粒 (~2ug)10ulTotal25ul混合均匀后37℃孵育2小时；1.2 用Axygen PCR纯化试剂盒纯化酶切产物，最终溶于15 ul elution Buffer中；2、BP重组2.1 按下表配制BP重组体系：TE buffer (elution buffer from Invitrogen miniprep kit)5.0ulLinearized attB expression clone 2.0ulDoner vector with attP site (pDONR 221)1.0ul2.2 取出BP clonase II冰上溶解后混匀；2.3 在2.1配制的体系中加入2.0ul BP clonase II，混合均匀；2.4 室温孵育过夜；2.5 取3ul至一管中，其余-20℃保存；3．LR重组3.1 按下表配制LR重组反应体系：BP重组质粒3.0ulDestination vector (pLenti6.3/V5-DEST)1.0ulLR clonase enzyme mix2.0ulddH2O4.0ul3.2 25℃反应5小时；3.3 加入1ul的蛋白酶K，37℃反应10分钟；3.4 取5ul重组反应液转化100ul的stbl3感受态细胞。细胞涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养；3.5 从平板挑单克隆接种于4ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养；3.6 用Axygen质粒DNA质粒试剂盒提取质粒；3.7 质粒测序验证，测序结果显示序列完全正确，慢病毒载体构建成功。ZNF185基因慢病毒表达载体的包装，具体过程如下：1、293T细胞长至培养瓶板底面积80%左右时，通过常规消化、收集、离心、重悬、洗涤后吹打分散，计数后稀释为6×106个/ml接种于培养皿中，37℃，体积分数5% CO2培养箱培养12h；2、移去培养液，加入Opti-MEM培养液；3、将3µg慢病毒表达载体和9µg Packaging Mix加入到1.5ml Opti-MEM中，混合液混匀；4、将36µl lipofectamine2000和1.5ml Opti-MEM混匀，室温放置5min；5、混匀步骤3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种慢病毒干扰载体，其特征在于：所述载体含有小鼠的ZNF185基因干扰片段，所述慢病毒载体的shRNA序列是：F:5′‑TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA‑3′；R:5′‑CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒干扰载体，其特征在于：所述载体含有小鼠的ZNF185基因干扰片段，所述慢病毒载体的shRNA序列是：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′。2.一种如权利要求1所述靶向ZNF185的慢病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）ZNF185干扰载体的构建首先针对小鼠ZNF185基因（Gene ID: 22673）设计一套干扰序列，并合成miRNA oligos，退火后序列亚克隆到pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR载体中，测序验证；（二）ZNF185慢病毒载体构建将上述步骤（一）构建的miRNA干扰载体经单酶切后纯化；然后将线性化的干扰质粒与pDONR221载体进行BP重组反应，以获得含干扰序列的入门载体；然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒目的载体pLenti6.3/V5-dest进行LR重组反应，以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（一）ZNF185干扰载体构建，具体过程如下：(1)Oligo DNA的设计与合成针对ZNF185基因序列，通过BLOCK-iT RNAi Express数据库提交基因信息选择干扰位点，设计互补的Oligo DNA，正义链的5′端添加了TGCT，反义链的5′端添加了CCTG；其正义链与反义链序列分别为：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘智芳，冯卫国，尤新国，樊姝彤，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37