使用腺相关病毒（AAV）载体递送蛋白制造技术

本文公开了用于使用腺相关病毒（AAV）载体递送感兴趣的蛋白的组合物、系统和方法。公开了包括5’和3’反向重复序列（ITR）、启动子、用于多核苷酸的插入的限制性酶切位点和转录后调节元件的AAV载体。还公开了AAV载体用于表达中和抗体的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本文公开了用于使用腺相关病毒（AAV）载体递送感兴趣的蛋白的组合物、系统和方法。公开了包括5’和3’反向重复序列（ITR）、启动子、用于多核苷酸的插入的限制性酶切位点和转录后调节元件的AAV载体。还公开了AAV载体用于表达中和抗体的用途。【专利说明】使用腺相关病毒(AAV)载体递送蛋白相关申请根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求以下的美国临时申请号的优先权:2011年2月22日提交的61/445，449 ；2011年10月21日提交的61/550，123 ;和2012年2月14日提交的61/598，728。这些优先权申请通过引用整体明确并入本文。关于联邦政府赞助R&D的声明本专利技术根据美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的HHSN266200500035C，在政府的支持下完成的。政府在本专利技术中具有某些权利。序列表的引用本申请与电子格式的序列表一起提交。提供序列表作为2012年2月21日创建的、大小为148Kb、命名为SEQLISTING.TXT的文件。序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。背景专利
本申请一般涉及免疫学和基因递送领域。更具体地，本申请涉及用于生产感兴趣的蛋白诸如抗体的组合物、系统和方法。_9] 相关技术的描述尽管巨大的努力，至今还没有开发用于人类免疫缺陷病毒(HIV)的有效的疫苗。已鉴定出许多抗体为能够中和大部分循环的HIV毒株。尽管大量的努力集中在设计能够从头(de novo)诱发将针对相似表位的抗体的免疫原上，但传统的疫苗是否将能够诱发现有的广泛中和抗体的类似物仍然不清楚。作为免疫的替代，本文描述的载体介导的基因转移能够被用于设计现有的广泛中和抗体的分泌进入循环。现有的目标为生产遗传编码的治疗蛋白的方法仅导致有限水平的基因表达。例如，先前使用基于腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)的载体设计体液免疫的努力导致中度的抗体生产(Lewis等人，J.Virol.76:8769 - 8775 (2002))，其随后通过使用替代的衣壳(Fang等人Nature Biotechnol., 23:584 - 590 (2005))和以运载能力为代价的增加表达的自身互补 AAV (scAAV)载体(McCarty., Mol.Ther., 16:1648 - 1656 (2008))被改进。近来，将scAAV载体用于由小的、人工融合的抗体片段组成的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)-中和免疫粘附素的直接表达(Johnson等人，Nature Med.，15 (8): 901 - 906 (2009))。然而，该预防的功效被针对免疫粘附素蛋白的内源免疫应答所限制。另外，现有的基于AAV方法的效カ的缺乏可追溯到AAV载体无能力传递长度大于约4800碱基对的序列Jong等人，HumanGene Therapy, 7:2101-2112 (1996)。AAV载体的该限制已使得难以设计包含编码治疗蛋白的基因和表达促进元件以允许用于特别是体内(in vivo)高水平生产的载体。因此，对能够有效表达基因的紧凑型载体和系统的开发具有迫切的需求。概述 本文公开的ー些实施方案提供了病毒载体，其中该病毒载体包括:腺相关病毒(AAV)的 5，末端反向重复序列(inverted terminal repeat, ITR)和 3，AAV ITR ;启动子；启动子下游的限制性酶切位点以允许编码ー个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入，和限制性酶切位点下游的转录后调节元件，其中启动子、限制性酶切位点和转录后调节元件位于5’ AAV ITR的下游和3’ AAV ITR的上游。在一些实施方案中，该病毒载体还包括插入在限制性酶切位点并与启动子可操作地连接的多核苷酸，其中多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区。在一些实施方案中，多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区的直接上游的信号肽序列。在一些实施方案中，信号肽选自以下组成的组:干扰素的信号肽、人生长激素的信号肽、红细胞生成素(EPO)的信号肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的信号肽、胰岛素的信号肽、和其任何组合。在一些实施方案中，病毒载体包括与Kozak共有序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白选自以下组成的组:全长抗体、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(16?)、6<5?、红细胞生成素ぴ?0)、胰岛素、抗体？&13片段、抗体8(^片段、血友病相关的凝血蛋白、抗肌萎縮蛋白、溶酶体酸性脂肪酶、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、糖原贮积病相关的酶、和其任何变体。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是病毒的中和抗体。在一些实施方案中，病毒的中和抗体是人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或流感病毒的中和抗体。在一些实施方案中，HIV的中和抗体选自以下组成的组:bl2抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、和其任何变体。在一些实施方案中，HCV的中和抗体选自以下组成的组:AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。在一些实施方案中，流感病毒的中和抗体选自以下组成的组:F10杭-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、FI6抗-流感抗体、TCN32抗-流感抗体、和其任何变体。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是疟疾的中和抗体。在一些实施方案中，启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、鸡(6-肌动蛋白(CAG)启动子、泛素C (UBC)启动子、或其任何变体。在一些实施方案中，启动子包括剪接供体、剪接受体、或其任何变体。在一些实施方案中，剪接供体包括与SEQ ID N0:5具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，剪接受体包括与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子包括与SEQ ID N0:1具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子包括与SEQ ID N0:2-4中任ー个具有至少90%序列同一‘丨生的核苷酸序列。在一些实施方案中，转录后调节元件是病毒转录后调节元件。在一些实施方案中，病毒转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、こ型肝炎病毒转录后调节兀件(HBVPRE)、RNA 转运兀件(RNA transport element, RTE)、或其任何变体。在一些实施方案中，病毒载体还包括转录后调节元件下游的转录终止区。在ー些实施方案中，转录终止区包括SV40晩期poly (A)序列、兔(6-珠蛋白poly(A)序列、牛生长激素poly (A)序列、或其任何变体。在一些实施方案中，启动子包括内含子。在一些实施方案中，内含子是包括与SEQID NO: 8具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的合成的内含子。在一些实施方案中，多核苷酸包括免疫球蛋白的重链可变区的第一编码区和免疫球蛋白的轻链可变区的第二编码区。在一些实施方案中，第一编码区和第二编码区被2A序列分开。在一些实施方案中，2A序列是F2A序列。在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历杭德罗·本杰明·巴拉兹，大卫·巴尔的摩，
申请(专利权)人：加州理工学院，
类型：
国别省市：