复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。所述复制型重组人55型腺病毒载体是以同源重组技术将人55型腺病毒基因组环化，以同源重组及双抗性筛选技术敲除Ad55的E3基因，且可以整合入外源基因表达框，将E3基因缺失的Ad55载体质粒线性化后，转染哺乳动物细胞可成功拯救并大量生产，进一步经密度梯度离心得到纯化的重组Ad55载体，以该载体携带外源基因可在靶细胞内实现高效表达，且外源报告基因的活性可反映病毒的生长特性。本发明专利技术基于人Ad55的复制型载体可潜在地应用于：抗人55型腺病毒疫苗研发；抗人55型腺病毒药物及中和抗体筛选；抗其他病原体疫苗的研发；生物学研究的报告示踪系统等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体是涉及一种复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。
技术介绍
腺病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，其基因组约35-40kb，已知人腺病毒共7个亚群(A-G)，60多个血清型，其中3、4、7、14型感染可导致急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。近年来，出现了由人11型与14型腺病毒重组产生的55型腺病毒(以下简称Ad55)，因人群普遍缺乏针对这种病毒的免疫力，很容易引起呼吸道传染病疫情，尤其是入伍新兵、寄宿制学校、托幼机构等在封闭环境中生活的群体。目前，尚无针对腺病毒感染的特效治疗药物，亦无可在普通人群中使用的腺病毒疫苗。因此，构建基于Ad55病毒的复制型报告病毒，对于研发抗人55型腺病毒的疫苗、药物及中和抗体至关重要。同时，由于Ad55尚未大规模流行，人群中针对Ad55的中和抗体阳性率较低。因此，基于Ad55的基因载体可潜在的携带抗原基因或治疗性基因在普通人群中使用。腺病毒载体具有一系列优势，包括：1.安全性，腺病毒遗传背景相对清楚，基因组不整合至宿主染色体因而不会导致插入突变，删除其E1或E3基因可进一步降低腺病毒的致病力；2.有效性，腺病毒可高效感染分裂期及静息期细胞，携带的外源基因可长期高水平表达，具备较大的容纳外源基因的能力；3.生产工艺成熟，腺病毒可在宿主细胞中复制增长到很高的滴度因而容易大规模生产，理化性状稳定因而可方便地运输、储存等。因此，腺病毒载体已广泛用作基因表达载体、重组疫苗载体和基因治疗载体等，全球范围内已有数百项临床试验以腺病毒作为基因载体，居各类载体之首(24.8％)。我国具自主知识产权的基因治疗药物今又生(重组人p53腺病毒注射液)，即使用复制缺陷型的人5型腺病毒载体。然而，多数人体内由于既往腺病毒感染而产生一定水平的抗腺病毒免疫反应，包括抗腺病毒中和抗体和杀伤性T细胞(CTL)。研究表明非洲和南美等发展中国家和地区的人群中Ad2、Ad5中和抗体阳性率很高，甚至超过90％。我们的研究也表明广东地区人群中Ad5中和抗体阳性率高达75％。这些中和抗体会抑制腺病毒载体产品进入机体细胞，使其难以行使免疫或治疗功能。此外，针对腺病毒载体的CTL反应亦可杀死靶细胞而抑制治疗性基因的持续表达。为克服预存抗腺病毒免疫反应，研究者已开发一系列技术：1)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应。但是免疫抑制剂不具有特异性，往往带来显著的毒副作用，尤其是在免疫缺陷的人群。2)修饰或改造腺病毒载体表面蛋白，绕开预存中和抗体。腺病毒表面蛋白经修饰或改造之后，掩盖其中和表位，从而可有效的进入靶细胞发挥生物学功能。但是，包裹的腺病毒粒子在细胞内释放效率被削弱，而改造表面蛋白的腺病毒载体使用一次即可产生新的抗载体免疫反应，不能重复使用。3)以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术。PBMC分离并清洗之后，可经离心感染技术高效感染腺病毒载体。该技术可有效应用于经血液途径免疫或输送治疗性基因，但其应用范围有限。4)采用在人群中流行率较低的稀有血清型腺病毒作为载体。人群中针对稀有血清型腺病毒的预存免疫反应往往较低，因而这些载体在临床中具有极大的应用潜力。因此，基于人55型的腺病毒载体，一方面可为抗腺病毒疫苗、药物或中和抗体研究提供技术平台，另一方面也可作为肿瘤、遗传性疾病的基因治疗载体及抗其他传染性疾病如HIV、流感等的疫苗载体。此外，腺病毒基因组长达35-40Kb，较少出现单酶切位点，在目标区域敲除特定基因或整合外源序列有一定操作难度。目前常用的技术是在目标区域找到合适酶切位点(往往并非单一酶切位点)并进行部分酶切，使部分基因组在该位点断裂，与含重组臂并带有目的序列的质粒同源重组。该技术的缺陷在于，部分酶切往往导致多数基因组质粒未被有效切开，重组克隆难以通过抗性筛选高效获得。因此，本专利技术开发了一种基于基因组部分酶切以及双抗性筛选的重组技术，使得在目标区域整合入特定外源序列的操作更加简便易行。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种复制型人Ad55重组腺病毒载体及其制备方法。实现上述目的的技术方案如下。一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，包括以下步骤：(1)以人55型腺病毒基因组为模板，分别扩增人55型腺病毒基因组两端反向重复序列(ITR)作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A(即pAd55)；(2)以Ad55基因组为模板，扩增人55型腺病毒E3区两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与线性化的步骤(1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B(即pAd55ΔE3-Kana)；(3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的步骤(2)所述基因组质粒B同源重组，得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒，并整合入唯一酶切位点，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。或者，一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，包括以下步骤：(1)以人55型腺病毒基因组为模板，分别扩增人55型腺病毒基因组两端ITR区序列作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A(即pAd55)；(2)以Ad55基因组为模板，扩增人55型腺病毒E3区两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与如步骤(1)所述环化的基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B(即pAd55ΔE3-Kana)；(3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的基因组质粒B同源重组，得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒；(4)将Ad55基因的E3区两端序列连接至卡那抗性载体，并将外源序列插入至E3区两端序列之间，构建携带外源基因表达框的穿梭质粒，再与线性化后的基因组质粒C同源重组，在原E3区整合唯一酶切位点，得到E3区缺失并整合外源序列的基因组质粒，线性化后再转染哺乳动物细胞，离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。在其中一个实施例中，所述步骤(1)为：以Ad55基因组为模板，PCR得到Ad55基因组两端ITR区序列的重组臂L-arm及R-arm；L-arm连接至pUC载体得到pUC-L；R-arm以EcoRI+Xb本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)以Ad55基因组为模板，分别扩增基因组两端反向重复序列作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A；(2)以Ad55基因组为模板，扩增E3基因两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与线性化的步骤(1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B；(3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的步骤(2)所述基因组质粒B同源重组，得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒，并整合入唯一酶切位点，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以Ad55基因组为模板，分别扩增基因组两端反向重复序列作为同源重
组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大
肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A；
(2)以Ad55基因组为模板，扩增E3基因两端序列并反向连接至卡那抗性载
体，线性化后与线性化的步骤(1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那
双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B；
(3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的步骤(2)所述基因组质粒
B同源重组，得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒，并整合入唯一酶切位
点，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55
型腺病毒载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为：
以Ad55基因组为模板，PCR得到Ad55基因组两端ITR区序列的重组臂
L-arm及R-arm；
L-arm连接至T载体得到pT-L；R-arm以EcoRI+XbaI双酶切后连接至
EcoRI+XbaI双酶切的pT-L得到环化穿梭质粒pT-L+R；
pT-L+R以BamHI+EcoRI线性化后，与Ad55基因组共转化感受态细胞，得
到pAd55质粒。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为：
以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delE3
及R-delE3；
L-delE3以SpeI+EcoRI双酶切后连接至SpeI+EcoRI双酶切的pVax载体得到
pVax-L-delE3；R-delE3以EcoRI+XbaI双酶切后连接至EcoRI+XbaI双酶切的

\tpVax-L-delE3得到敲除E3基因的穿梭质粒pVax-delE3(L+R)；
pVax-delE3(L+R)以EcoRI线性化，pAd55以EcoRI经部分酶切线性化，共
转化感受态细胞，涂至氨苄、卡那双抗性平板，提取阳性克隆继续转化感受态细
胞，得到去除E3基因并在E3区引入唯一酶切位点SwaI的基因组质粒
pAd55ΔE3-Kana。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)为：
以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delK
及R-delK；

【专利技术属性】
技术研发人员：陈凌，冯立强，孙彩军，秦成峰，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44