The invention discloses a recombinant lentivirus vector PCGUR, the recombinant PCGUR lentivirus vector, by lentivirus vector PCGUR by restriction enzyme EcoRI and AgeI digested with AgeI and EcoRI connected to the sticky ends of specific fragment of the mmu-miR-199b-5p gene and recombination, the invention also discloses a lentivirus vector the recombinant PCGUR lentivirus and its construction method. The recombinant PCGUR lentivirus interference vector provided by the invention has the advantages of high transfection efficiency and high titer of lentivirus.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒，本专利技术还涉及一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒的构建方法及应用。
技术介绍
慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，慢病毒目前可以在细胞或者体内实现长效的外源基因表达和基因沉默。微小RNA(microRNA，miRNA)是目前研究最多的一类内源性非编码小分子RNA，长度约为19-23nt，miRNA能够在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的翻译抑制或降解，抑制蛋白质的合成，产生基因沉默效应。作为miRNA中的一员，mmu-miR-199b-5p是2003年由Lagos-Quintana首先从鼠细胞克隆得到，随着对其研究的不断深入，mmu-miR-199b-5P基因在子宫内膜癌、卵巢癌、子宫内膜异位症等多种疾病中都有异常的表达。mmu-miR-199b-5p通过影响细胞增殖、调亡、侵袭和血管形成，参与肿瘤形成发展的各个阶段。目前，miRNA在妇科常见疾病如子宫内膜癌、卵巢癌以及子宫内膜异位症中发挥作用的具体调控机制还不是十分清楚，但已有证据表明miRNA参与调控其发生发展。随着miRNA的深入研究，有望可能作为一种新的肿瘤生物学标记物，对其在癌前病变以及恶性肿瘤中的特异表达进行检测，有助于对妇科恶性肿瘤的早期诊断，尤其有助于对那些早期无明显临床症状的
【技术保护点】
一种重组PCGUR慢病毒干扰载体，其特征在于，将购买的慢病毒干扰载体PCGUR，经内切酶AgeI和内切酶EcoRI双酶切后，得到一个长序列片段和一个短序列片段，然后在所述长序列片段内，连入改造的mmu‑miR‑199b‑5p基因特异片段，得到重组PCGUR慢病毒干扰载体，所述改造的mmu‑miR‑199b‑5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种重组PCGUR慢病毒干扰载体，其特征在于，将购买的慢病毒干扰
载体PCGUR，经内切酶AgeI和内切酶EcoRI双酶切后，得到一个长序列片段
和一个短序列片段，然后在所述长序列片段内，连入改造的mmu-miR-199b-5p
基因特异片段，得到重组PCGUR慢病毒干扰载体，所述改造的
mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，
反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
2.根据权利要求1所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，其特
征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段
步骤1.1，化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其
核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，其核苷酸序列
如SEQIDNO.4所示；
步骤1.2，将步骤1.1中获得的正义链配置成正义链溶液，将步骤1.1中获
得的反义链配置成反义链溶液，经退火反应，获得改造的mmu-miR-199b-5p基
因特异片段；
步骤2，获得重组PCGUR慢病毒干扰载体
步骤2.1，购买慢病毒干扰载体PCGUR，并利用内切酶AgeI和内切酶EcoRI
对慢病毒干扰载体PCGUR进行双酶切，得到一个长序列片段和一个短序列片
段，然后将长序列片段进行回收，获得慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段
产物；
步骤2.2，将步骤1.2中获得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和
步骤2.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连
接酶连接，获得连接产物，然后将所述连接产物回收，获得重组PCGUR慢病
毒干扰载体。
3.根据权利要求2所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，其特
征在于，所述步骤1中，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段，具体按
照以下步骤实施：
步骤1.1a，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其核苷酸
序列如SEQIDNO.1所示，并在其5’端添加核苷酸序列ccgg，在3’端添加核苷
酸序列ttttttg，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链；
化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，其核苷酸序列如SEQ
IDNO.2所示，并在其5’端添加核苷酸序列aattcaaaaaa，形成改造的
mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链。
4.根据权利要求2所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，其特
征在于，所述退火反应的反应体系为：正义链溶液17-18μL，反义链溶液
17-18μL，10倍浓缩的退火缓冲液4-6μL，总体积40μL，将该退火体系混匀后
置于95℃水浴10-20min，之后自然冷却至室温；
所述双酶切的酶切反应体系包括：1-2μL的慢病毒干扰载体PCGUR，10
倍浓缩的内切酶缓冲液5-6μL，1-2μL的内切酶AgeI，1-2μL的内切酶EcoRI，
38-42μL的双蒸水，总体积50μL，反应温度37℃，反应时间2h，其中，慢病
毒干扰载体PCGUR的浓度为0.5-1.5μg/μL，内切酶AgeI的浓度为8-12U/μL，
内切酶EcoRI的浓度为8-12U/μL；
所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤2.1中获得的慢病毒干
扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接的连接反应体系为：
改造的mmu-miR-199b-5p基...
【专利技术属性】
技术研发人员：王煜，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15
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