特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法，属于生物制药技术领域，包括如下步骤：S100、RET慢病毒的包装制备：将RET基因片段克隆至慢病毒表达载体后进行包装，获得含有RET基因的慢病毒；S200、RET修饰的免疫细胞的制备：将所述含有RET基因的慢病毒与人体免疫细胞一起在含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，得到RET基因修饰的免疫细胞。本发明专利技术将RET基因作为炎症相关抗原基因，利用慢病毒作为载体转染免疫细胞细胞，诱导刺激针对修饰炎症的各项免疫细胞，从而介导针对炎症细胞的特异性免疫反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，更具体的说，涉及一种特异性治疗及修饰慢性炎症的免疫细胞的制备方法。
技术介绍
炎症是一个常见的生理反应，指组织受到外伤或病原感染刺激时，所激发的一种先天性免疫应答。炎症反应始于受损组织释放信号因子，刺激白细胞，增强细胞分裂速度重塑组织修复损伤。反应止于伤口愈合，机体的内环境及外环境达到新的平衡。通常情况下，炎症反应是对机体有利的，但是慢性炎症对机体是有害的。慢性炎症中，由于免疫反应的异常，炎症反应可能在机体未受损的情况下发生且没有适时终止。致炎因子持续存在并且长期的损伤组织，刺激细胞增殖修复。长期的慢性炎症可以引起人体自身免疫系统的紊乱，进而引起多种疾病，如花粉症，动脉粥样硬化，类风湿性关节炎，肺炎肝炎肾炎甚至癌症。很多基础以及临床研究表明炎症可以加速DNA突变约30倍，是一个明确的癌症的易感因素之一。超过1/5的癌症是由慢性炎症引起的，常见的炎症转为癌症的病例包括肺癌肠癌肝癌胃癌。过度的修复局部炎症是导致细胞过度增值和器官衰老的主因。在2012年世界范围内约有1410万新增癌症致死病例，约280万人因炎症患肿瘤，约170万人死于炎症导致的肿瘤。在发展中国家，由于人口的激增和环境的影响，新增的炎症型肿瘤会迅速增长。目前市场有一些对器官老化和癌症有潜在防治作用的抗炎药物。例如2010年英国《柳叶刀》的文章指出长期服用少剂量的阿司匹林(75毫克)可以预防心脑血管疾病，并降低8％-16％的癌症死亡率。口服性抗炎药物的长期服用虽然有一些益处，但并不适合全部人群，并常伴有过敏，水肿，消化道出血等副作用。如何有效的长期进行全身慢性炎症的抑制和修饰，并尽量减少副作用的发生在现有技术背景下仍属于相对空白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于：提供一种特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法，解决现有技术中有效的长期进行全身慢性炎症的抑制和修饰仍属于相对空白的问题。本专利技术解决上述问题的技术方案为：一种特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：S100、RET慢病毒的包装制备：将RET基因片段克隆至慢病毒表达载体后进行包装，获得含有RET基因的慢病毒；S200、RET修饰的免疫细胞的制备：将所述含有RET基因的慢病毒与人体免疫细胞一起在含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，得到RET基因修饰的免疫细胞。在本专利技术提供的特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法中，所述步骤S100还包括如下步骤：S101、扩增RET基因：将大肠提取的cDNA作为PCR扩增模板，加入Taq聚合酶，使用如下RET扩增引物于扩增体系中进行PCR扩增及纯化：RET-F:5’-ATGGCGAAGGCGACGTCCGGT-3’RET-R:5’-TTAACTATCAAACGTGTCCAT-3’；S102、构建RET慢病毒表达载体：将RET基因片段与慢病毒表达载体pLenti6.3/V-TOPO进行生物酶链接处理后，得到慢病毒克隆产物；将所述慢病毒克隆产物与E.coliDH5a感受态细胞进行转化孵育，再通过氨苄青霉素筛选处理后于含有氨苄青霉素的培养基中再次孵育，分离纯化重组质粒DNA即得到RET慢病毒表达载体pLenti-RET；S103、包装制备RET慢病毒表达载体：所述慢病毒表达载体pLenti-RET，与转染试剂混合后进行孵育形成DNA转染试剂复合物后将其与包装细胞293FT进行包装孵育处理，获得含有所述RET基因的慢病毒RET-LV。在本专利技术提供的特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法中，人体免疫细胞为PBMC、CIK、NK、DC细胞中至少一种。在本专利技术提供的特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法中，所述步骤S200还包括如下步骤：S201、免疫细胞的分离培养：抽取人体外周血，使用淋巴细胞分离液分离得到免疫细胞，使用含有10％自体血浆的淋巴培养液培养后收集免疫细胞；S202、RET-LV感染免疫细胞：将所述含有RET基因的慢病毒与人体免疫细胞一起在含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，所述完全培养基为含有10％自体血浆的淋巴培养液。在本专利技术提供的特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法中，所述步骤S202中，所述RET-LV与免疫细胞混合后，细胞数量比例为20-100:1。在本专利技术提供的特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法中，所述步骤S202中，所述RET-LV与免疫细胞细胞培养基中聚凝胺的浓度为8μg/ml。实施本专利技术，具有如下有益效果：本专利技术将RET基因作为炎症相关抗原基因，利用慢病毒(LV:Lentivirus)作为载体转染免疫细胞细胞，诱导刺激针对修饰炎症的各项免疫细胞，从而介导针对炎症细胞或组织的特异性免疫反应。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法较佳实施例的流程图；图2是本专利技术实施例中RET基因扩增产物的电泳条带图；其中M表示DNALadder；图3是本专利技术实施例中队重组质粒酶切产物的电泳条带图；其中M表示DNALadder；1，2，3，4标识为从四个不同菌粒中所提取的DNA；图4是实施例中RET-PBMC和对比例中的WT-PBMC中RET蛋白表达水平的免疫染色图；图5是实施例中RET-PBMC和对比例中的WT-PBMC中RET基因表达(qRT-PCR)水平柱状图；图6是实施例中RET-PBMC和对比例中的WT-PBMC中RET蛋白表达水平的免疫印迹结果图；图7是实施例及对比例中分别培养的RET-PBMC，WT-PBMC与HEVEC共培养后在LPS刺激下所分泌的肿瘤坏死因子TNFalpha的柱状图；图8是实施例及对比例中分别培养的RET-PBMC，WT-PBMC与HEVEC共培养后在LPS刺激下所分泌的黏附因子ICAM1的柱状图；图9是实施例及对比例中分别培养的RET-PBMC，WT-PBMC与HEVEC共培养后在LPS刺激下所分泌的白介素1β的柱状图；图10是实施例及对比例中分别培养的RET-PBMC，WT-PBMC与HEVEC共培养后在LPS刺激下细胞凋亡的比例。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的实施例进行具体描述。长期的慢性炎症通过不停刺激器官的修复和增殖可以诱发一系列的病变包括癌症。炎症同时也是导致器官衰竭机体衰老的主要原因之一。本专利技术通过对免疫细胞特定性的改造以达到让其抑制和修饰炎症的目的。通过长期的阶段性的治疗，预期可以有效的修复或抑制慢性炎症，以减少癌症的发病几率和器官衰老的速度。自体免疫细胞进行特异性改造后可以把副作用以及排斥作用降到最低。本专利技术特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：S100、RET慢病毒的包装制备：将RET基因片段克隆至慢病毒表达载体后进行包装，获得含有RET基因的慢病毒，即RET-LV；S200、RET修饰的免疫细胞的制备：将所述含有RET基因的慢病毒与人体免疫细胞一起在含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，得到RET基因修饰的免疫细胞，即RET-免疫细胞。上述步骤100中的RET(receptortyrosinekina本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S100、RET慢病毒的包装制备：将RET基因片段克隆至慢病毒表达载体后进行包装，获得含有RET基因的慢病毒；S200、RET修饰的免疫细胞的制备：将所述含有RET基因的慢病毒与人体免疫细胞一起在含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，得到RET基因修饰的免疫细胞。

【技术特征摘要】
1.一种特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S100、RET慢病毒的包装制备：将RET基因片段克隆至慢病毒表达载体后进行包装，获得含有RET基因的慢病毒；S200、RET修饰的免疫细胞的制备：将所述含有RET基因的慢病毒与人体免疫细胞一起在含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，得到RET基因修饰的免疫细胞。2.根据权利要求1所述的特异性修饰炎症的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S100还包括如下步骤：S101、扩增RET基因：将大肠提取的cDNA作为PCR扩增模板，加入Taq聚合酶，使用如下RET扩增引物于扩增体系中进行PCR扩增及纯化：RET-F:5’-ATGGCGAAGGCGACGTCCGGT-3’RET-R:5’-TTAACTATCAAACGTGTCCAT-3’；S102、构建RET慢病毒表达载体：将RET基因片段与慢病毒表达载体pLenti6.3/V-TOPO进行生物酶链接处理后，得到慢病毒克隆产物；将所述慢病毒克隆产物与E.coliDH5a感受态细胞进行转化孵育，再通过氨苄青霉素筛选处理后于含有氨苄青霉素的培养基中再次孵育，分离纯化重组质粒DNA即得到RET慢病毒表达载体pLenti-RET；S103、包装制备R...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖洪宝，
申请(专利权)人：深圳中健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44