本发明专利技术提供了一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及前列腺癌特异性抗原多肽组合；所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述前列腺癌特异性抗原多肽组合为SSX-2-A2、PIWIL2-A2、PAP-A2、PSA-A2、PSA-A3、hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2、Survivin-A3、PSCA-A2、COX-2-A2/3及MTA1-A2抗原多肽；本发明专利技术的试剂盒可以高效地以主动诱导/被动诱导相结合的方式激活前列腺癌病人特异性的免疫反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种增强抗癌免疫的试剂盒，尤其设及一种用于激活前列腺癌特异性 免疫反应的试剂盒。
技术介绍
前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生 殖器官肿瘤病理学和遗传学》中前列腺癌病理类型上包括腺癌（腺泡腺癌）、导管腺癌、尿 路上皮癌、鱗状细胞癌、腺鱗癌。其中前列腺腺癌占95%W上，因此，通常我们所说的前列腺 癌就是指前列腺腺癌。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9. 92/10万，列男性恶 性肿瘤发病率的第6位。发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着 年龄的增长而增长，高峰年龄是70~80岁。家族遗传型前列腺癌患者发病年龄稍早，年龄 《55岁的患者占43%。前列腺癌使得前列腺腺体逐渐增大，前列腺腺体压迫尿道可引起 进行性排尿困难，表现为尿线细、射程短、尿流缓慢、尿流中断、尿后滴渐、排尿不尽、排尿费 力，此外，还有尿频、尿急、夜尿增多、甚至尿失禁。肿瘤压迫直肠可引起大便困难或肠梗阻， 也可压迫输精管引起射精缺乏，压迫神经引起会阴部疼痛，并可向坐骨神经放射。前列腺癌 亦可侵及膀脫、精囊、血管神经束，引起血尿、血精、阳瘦。盆腔淋己结转移可引起双下肢水 肿。前列腺癌常易发生骨转移，引起骨痛或病理性骨折、截擁。前列腺癌也可侵及骨髓引起 贫血或全血象减少，对患者造成极大痛苦。 自进入二十一世纪W来，分子生物学与免疫学的长足进步为临床肿瘤治疗提供了 新的策略。通过分子生物学的手段已鉴定出大量的肿瘤细胞特异性的抗原，并通过生物信 息学的手段分析出其被免疫细胞识别的位点，运为重建患者的肿瘤特异性免疫反应带来的 可能。但是最近十年W来的一系列临床试验结果显示，W肿瘤特异性抗原肤为基础的肿瘤 疫苗的临床效果令人失望，其中一个重要的原因是抗原提呈过程的缺陷。 XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12,发现 DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肤回输至 小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。感染空载病毒的DC细胞并不能有效的激发相应的免 疫反应，回输后对小鼠的肿瘤大小无显著性的影响。该研究提示了高表达IL12的DC细胞 对于肿瘤疫苗发挥其抗癌临床作用的重要性。DC细胞是哺乳类动物体内具有抗原提呈能力的一类细胞，其主要功能是摄取、加 工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。T细胞因此被激活而生成MHC-I类限制性 CD8阳性细胞毒性T细胞（切totoxicTIympho巧te，CTL)和MHC-II类限制性的CD4阳性的 一型T辅助细胞（typelThelper,Thl)。一型极化树突状细胞灯ypel化IarizedDemlritic cell,DC1)是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DCl细胞的重要的特 征是高表达IL12p70W及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特异性的CD8巧细胞和 CD4+Thl细胞相关的免疫反应。RotibieB.Mailliard等证实了DCl体外诱导黑色素瘤抗原 特异性的CTL细胞的能力可达到正常的成熟DC细胞的40倍W上。A化ianaTLarregina 等人还发现DCl细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅 助性T细胞对肿瘤组织的浸润。因此，高表达IL12的DCl细胞负载肿瘤特异性抗原肤可W 为增强抗原肤为基础的肿瘤治疗疗效提供了一种策略，但现有技术中还没有能够相应的、 成熟的并适用于激活前列腺癌病人特异性免疫反应的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出一种试剂盒用于前列腺癌的临床治疗。 体外诱导肿瘤患者自体的DC细胞，获得富集DCl细胞的产物；DCl细胞负载肿瘤特异性肤 段组合，可W用于体外或体内的肿瘤抗原特异性的细胞毒性T细胞的诱导。 为了解决上述技术问题，本专利技术所提供的技术措施为： 本专利技术提供了 一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒，包括有 RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、比-4、INF丫W及前列腺癌特异性抗原多肤组 合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所 述前列腺癌特异性抗原多肤组合包括SSX-2-A2、PIWIL2-A2、PAP-A2、PSA-A2、PSA-A3、 hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2、Survivin-A3、PSCA-A2、C0X-2-A2/3 及MTA1-A2 抗原 多肤，其多肤序列分别如SEQIDNo. 1，SEQIDNo. 2,SEQIDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQID No. 5,SEQIDNo. 6,SEQIDNo. 7,SEQIDNo. 8,SEQIDNo. 9,SEQIDNo. 10,沈QIDNo. 11 及沈QIDNo. 12所示。 为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括： 优选地，NK细胞与K562细胞共培养上清通过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10 比例共培养并加入IFNa，24小时后收集培养基上清而获得。 W11] 优选地，所述T细胞培养上清的制备过程中，首先分离外周血单核细胞，淋己 细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入CD3CD28Beads，2地后加入等量培养基，4化后收集T细胞培养上清。 优选地，利用试剂盒激活前列腺癌病人肿瘤特异性免疫反应包括W下步骤： 步骤一，分离病人外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞， 加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，并加入前 列腺癌特异性抗原多肤组合，获得负载有前列腺癌特异性抗原多肤组合的成熟DC细胞； 步骤二，将所述步骤一中制得的成熟DC细胞用INF丫W及所述的NK细胞与K562 细胞共培养上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DCl细胞； 步骤=，利用步骤二所获得的DCl细胞进行体内主动诱导和/或体外被动诱导。 优选地，所述NK细胞来源于人类厮带血。 优选地，所述T细胞培养上清为利用自体或异体T细胞获得。 优选地，所述步骤=中的体内主动诱导过程为将所述步骤二所获得的DCl细胞回 输到病人体内。 优选地，所述步骤=中的体外被动诱导过程为将所述步骤二所获得的DCl细胞与 T细胞混合培养，并再次负载前列腺癌特异性抗原多肤，然后收集细胞，回输到病人体内。 优选地，试剂盒还可W包括GG巧51培养基、DMEM/F12培养基或DMEM培养基。 本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，本专利技术的技术效果体现在W下几个 方面： 首先，本专利技术提供了一组用于前列腺癌免疫治疗的特异性抗原多肤组合，该组合 包含了多种前列腺癌细胞的特异性表达抗原的肤段。运些肤段包括了HLA-A2与A3呈递的 序列区域，覆盖了 80%W上的已报道的前列腺癌细胞特异性抗原。因此，我们提供了一种新 的前列腺癌特异性抗原多肤组合，有利于激活罹患前列腺癌病人的针对肿瘤细胞的获得性 免疫反应。 其次，本专利技术还提供了一种利用本专利技术的试剂盒，体外制备成熟DCl细胞，用于负本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒，其特征在于，包括有RPMI‑1640培养基、细胞培养上清、GM‑CSF、IL‑4、INFγ以及前列腺癌特异性抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述前列腺癌特异性抗原多肽组合为序列如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11及SEQ ID No.12的多肽组合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，叶圣勤，汪鑫，瞿苏，
申请(专利权)人：上海隆耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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