一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法及制得的MSC‑L细胞技术

本发明专利技术公开了一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：分离间充质干细胞，并进行原代培养和传代培养；通过构建逆转录和慢病毒载体pMIGR3‑hLIGHT、pCDHEF‑hLIGHT质粒，将人LIGHT基因转入间充质干细胞构建MSC‑L细胞，该MSC‑L细胞为表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞。本发明专利技术还涉及一种上述方法制备的MSC‑L细胞及其应用。本发明专利技术采用脐带作为MSC来源，将人LIGHT基因转入MSC，MSC将LIGHT输送到肿瘤组织，LIGHT修饰的MSC可以通过产生强有力的抗肿瘤细胞以及肿瘤相关间质细胞的免疫反应而改变宿主对肿瘤的耐受状态，从而有效控制肿瘤，本发明专利技术可进行大规模的制备，用于多种实体恶性肿瘤治疗以及癌症预防。

An expression of human immune stimulating factor LIGHT mesenchymal stem cell preparation method and prepared MSC L cells

The invention discloses a preparation method of immune stimulating factor LIGHT expression of human mesenchymal stem cells, which comprises the following steps: isolation of mesenchymal stem cells, and primary culture and subculture; by constructing retroviral and lentiviral vector pMIGR3 hLIGHT, pCDHEF plasmid hLIGHT, the human LIGHT gene to construct the MSC mesenchymal stem cells L cells, the MSC L cells for expression of human immune stimulating factor LIGHT mesenchymal stem cells. The invention also relates to a L MSC cell above preparation method and its application. The invention adopts the umbilical cord as a source of MSC, the human LIGHT gene into MSC, MSC LIGHT will be transported to the tumor tissue, LIGHT modified MSC can produce potent anti tumor cells and tumor associated stromal cells of the immune response and the change of tolerance to tumor from the host, and effective cancer control, the invention can carry out large-scale the preparation for different kinds of malignant tumor treatment and prevention of cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法及制得的MSC-L细胞
本专利技术涉及生物免疫治疗
，尤其涉及一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法及制得的MSC-L细胞及其应用。
技术介绍
肿瘤组织除了含有肿瘤细胞，还含有大量的肿瘤基质，肿瘤基质往往是肿瘤肆意扩张的帮凶。首先，肿瘤基质为肿瘤进展提供稳定的微环境，如同一道屏障，可妨碍治疗药物有效进入。而且，肿瘤基质可以通过直接接触或者分泌细胞因子促进肿瘤增殖。另外，基质细胞还抑制宿主免疫，诱导肿瘤免疫耐受。这些发现均提示肿瘤基质对肿瘤发展至关重要。有研究者发现，仅破坏肿瘤基质就可使肿瘤得到很好的控制，至少可以保持肿瘤与宿主处在一个相对稳定的平衡状态。对大多数肿瘤组织来说，肿瘤基质往往如同一道屏障，可妨碍治疗药物有效进入，是肿瘤肆意扩张的帮凶。而且，基质细胞常常抑制宿主免疫，诱导肿瘤免疫耐受。在临床工作中，人们发现肿瘤细胞往往会最终克服宿主的免疫系统而使宿主消亡。因此，改变肿瘤免疫抑制性的微环境对有效延长患者生存期至关重要。克服靶向输送抗肿瘤药物遇到的肿瘤免疫抑制问题，甚至是改变肿瘤免疫抑制性的微环境，以及如何通过免疫刺激因子逆转免疫抑制性微环境，继而靶向抗肿瘤的问题亟待解决。由于肿瘤组织的无序性，传统的给药手段往往难以有效的到达肿瘤组织内部。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCS)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，存在于骨髓、外周血、脐血、松质骨、脂肪组织滑膜和脐带，具有很强的免疫调节作用，对肿瘤免疫耐受起重要作用。MSCs在静息状态下有低水平的MHC-Ⅰ表达，而通常不表达MHC-Ⅱ以及共刺激因子CD80、CD86、CD40，共刺激因子的缺失往往导致T细胞无能，因此MSCs的抗原呈递能力以及进一步活化免疫细胞的能力很弱。此外，MSCs还可以通过直接接触或者通过释放细胞因子抑制T细胞增殖。除了可以抑制T细胞，有人证明MSCs可通过直接接触及释放细胞因子的方式抑制B细胞活化以及抗体分泌。此外，MSCs还可以抑制NK细胞以及树突状细胞(DC)的功能，抑制分泌TNF-α而促进IL-10分泌，很显然，这将进一步导致Th1细胞分泌IFN-γ减少，而促使Th2分泌IL-4，从而削弱抗肿瘤免疫，更何况未成熟的DC本身对肿瘤免疫耐受起重要作用。由此看出，MSCs对宿主具有较强的免疫负向调控能力。研究发现MSCs可向炎性组织特异性趋化，而肿瘤组织则被认为是一种无法治愈的慢性炎症，因此希望借助MSCs来运载抗肿瘤药物以达靶向抗肿瘤作用。许多研究只是将载药的MSCs在体外与肿瘤细胞混合或注射到异种移植瘤动物模型，而忽略了MSCs本身有较强的免疫抑制作用，其可为肿瘤细胞提供避开免疫攻击的庇护场所，将极有可能诱导肿瘤免疫耐受的发生。而且有研究显示MSCS是肿瘤基质细胞的重要来源，MSCs向肿瘤组织趋化，为肿瘤增殖提供合适的微环境，通过与肿瘤细胞相互接触或者通过分泌生长因子及趋化因子，促进肿瘤增殖甚至转移，还可以通过分化成肿瘤血管周细胞、成纤维细胞进一步促进肿瘤生长。因此，将MSCs作为载体输送抗肿瘤药物，往往会降低相应药物的抗肿瘤效应。已有报道称这种方法可以将肿瘤消退到一定程度，但很少有报道怎样改造MSCs本身来逆转肿瘤抑制微环境。LIGHT是肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)中一种很强的免疫刺激因子，其能在肿瘤组织激发强有力的抗肿瘤免疫。与其他的家族成员一样，可经诱导而活化。外周静息的T细胞经MPA和PHA共同刺激后，其表达水平明显地升高，表明LIGHT的表达受免疫细胞的高度调节，且在免疫细胞的调节中起一定的作用。LIGHT通过其3个受体发挥不同的作用。对于同时表达有LTβR和TR2/HVEM的肿瘤细胞(eg.MDA-MB-231)，LIGHT可诱导其凋亡；而对仅表达HVEM受体的T细胞则刺激其增生。此外，LIGHT对T细胞活化提供共刺激信号,其共刺激作用的程度与B7-CD28信号传导途径相当且不依赖于CD28。组成性表达LIGHT可使淋巴组织高表达CCL21趋化因子，后者对T细胞从血管渗出及归巢起重要作用。最近的研究表明LIGHT对免疫活化，尤其是对抗肿瘤免疫起关键作用。例如，将LIGHT在肿瘤组织表达，可促使大量T细胞向肿瘤组织趋化。而且，因为有LIGHT的存在，T细胞进入肿瘤组织以后，不是被诱导成免疫耐受，而是被极大的活化，并从而使肿瘤得以清除。显然，LIGHT在肿瘤微环境下对免疫细胞的活化起至关重要的作用。因此，专利技术人拟将LIGHT基因转入MSCs构建MSC-L细胞，以观察MSC-L细胞是否可将LIGHT输送到肿瘤组织，通过改变肿瘤微环境来打破宿主对肿瘤免疫耐受。但上述MSC-L细胞对的构建仍存在以下问题：1)如何选取方便、快捷的方法，使获得的MSCs活性好，纯度高。分离MSCs的有效方法有贴壁筛选法，酶消化离心法以及根据细胞相对特异的表型进行流式分选或者免疫磁珠分选。酶消化离心以及流式细胞分选等方法，虽然获得的细胞会相对较纯，但往往因为反复冗长的操作过程，可能会使细胞受损；加之分选之后细胞密度较稀，不能获得其他细胞旁分泌释放的细胞因子刺激，生长往往比较缓慢；2)原代培养的MSCs易于老化，到一定代次之后常常难以扩增，故需要提高间充质干细胞的增殖能力并同时避免细胞老化，以获得足够研究用的材料以及避免代次之间因为老化原因而带来的非特异性差别；3)MSCs可以特异性向肿瘤组织趋化，因此被用作载体输送抗肿瘤活性分子以期达到靶向抗肿瘤作用。由于本身就有很强的免疫抑制作用，而且肿瘤组织乃至肿瘤患者往往也处于免疫抑制状态，如何改变肿瘤患者特别是肿瘤局部组织免疫抑制性的微环境；4)将LIGHT转入MSCs后能否稳定表达，增殖分化能力如何，是否有成瘤性；5)将LIGHT转入MSCs后，MSCs可否将LIGHT靶向输入肿瘤组织，并产生强有力的抗肿瘤免疫；6)肿瘤生长受抑制一般在以下情况下可发生：肿瘤细胞增殖受阻；肿瘤细胞发生调亡；肿瘤血管生成受到破坏；抗肿瘤免疫活化，机体有完好免疫监视功能。需确定哪一种抗肿瘤机制在MSC-L介导的抗肿瘤效应中起作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法，该制备方法所得的MSC-L细胞中，MSC将LIGHT输送到肿瘤组织，LIGHT修饰的MSC可以通过产生强有力的抗肿瘤细胞以及肿瘤相关间质细胞的免疫反应而改变宿主对肿瘤的耐受状态，从而有效控制肿瘤。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法，其包括如下步骤：(1)分离间充质干细胞，并进行原代培养和传代培养；(2)构建带有LIGHT基因的逆转录病毒和慢病毒；(3)将步骤(2)制备的带有LIGHT基因的逆转录病毒或慢病毒转入步骤(1)获得的间充质干细胞，构建MSC-L细胞。本专利技术还对制备的MSC-L细胞进行了抗肿瘤作用效果试验，包括MSC-L细胞的小鼠体内抗肿瘤实验结果等。为了进一步优化上述制备方法，本专利技术的技术措施还包括：进一步地，所述步骤1)中的分离间充质干细胞的分离方法包括贴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离间充质干细胞，并进行原代培养和传代培养；(2)构建带有LIGHT基因的逆转录病毒和慢病毒；(3)将步骤(2)制备的带有LIGHT基因的逆转录病毒或慢病毒转入步骤(1)获得的间充质干细胞，构建MSC‑L细胞。

【技术特征摘要】
1.一种表达人源免疫刺激因子LIGHT的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离间充质干细胞，并进行原代培养和传代培养；(2)构建带有LIGHT基因的逆转录病毒和慢病毒；(3)将步骤(2)制备的带有LIGHT基因的逆转录病毒或慢病毒转入步骤(1)获得的间充质干细胞，构建MSC-L细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的分离间充质干细胞的分离方法包括贴壁筛选法、酶消化法以及根据细胞相对特异的表型进行流式分选或者免疫磁珠分选。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的间充质干细胞为来源于骨髓、外周血、松质骨、脂肪组织、脐血或脐带的间充质干细胞。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的间充质干细胞为来源于脐血或脐带的间充质干细胞。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)构建带有LIGHT基因的逆转录病毒和慢病毒的步骤包括：1)构建逆转录病毒和慢病毒载体pMIGR3-hLIGHT、pCDHEF-hLIGHT质粒，并获得有选择抗生素的表达质粒；2)将步骤1)构建的pMIGR3-hLIGHT质粒或相应带选择抗生素的质粒和包装质粒pCL-Ampho转染至293X细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨选明，汪鑫，傅阳心，叶圣勤，徐闻达，
申请(专利权)人：上海隆耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31