一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体的结构为scFv(X)‑(Y)CD3zeta‑MN；其中，X包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体；Y为共刺激受体的胞内区，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4‑1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226；M为gamma chain家族细胞因子受体的胞内区，所述细胞因子受体选自IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Ra；N为IL2Rg胞内区。本发明专利技术还涉及一种由上述嵌合抗原受体的重组表达载体构建的CAR‑T细胞及其制备方法和应用。本发明专利技术所述的CAR‑T细胞显著提高了肿瘤杀伤能力和扩增能力，该CAR‑T细胞包含第三信号受体，具有潜在的增强效应的功能，且只对CAR‑T细胞有作用，降低了造成免疫副作用的风险。

A chimeric antigen receptor containing the third signal receptor and its application

【技术实现步骤摘要】
一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及细胞免疫治疗
，尤其涉及一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
利用免疫学治疗手段来攻克肿瘤，一直是免疫学在转化医学方面应用的重要方向。随着各种组学(基因组学，蛋白组学等)的发展，肿瘤细胞由于突变产生的免疫原性得到了广泛的认可，这为肿瘤免疫治疗奠定了理论的基础。同时，随着肿瘤免疫学研究自身的积累，肿瘤免疫治疗近期取得了巨大的进步，一系列新的免疫治疗手段逐步进入临床。当前的肿瘤免疫学研究，奠定了T细胞杀伤在肿瘤免疫治疗中的中心地位，而嵌和抗原受体T细胞(CAR-T细胞)就是结合了抗体的靶向识别和T细胞的肿瘤杀伤功能，人工修饰生成的肿瘤杀伤细胞。嵌和抗原受体T细胞的概念最早在1989年被Gross，Waks和Eshhar提出，他们将识别TNP的抗体表达在T细胞上，实现了抗原特异性的、非MHC限制的T细胞的活化和效应的增强，并提出了CAR-T技术在肿瘤治疗中的应用的概念。根据这一原理，将具有肿瘤特异性的抗体嵌入T细胞，将赋予T细胞新的杀瘤能力。之后，CAR-T技术被引入到抗肿瘤临床试验中，但早期的CAR-T细胞由于其胞内信号传递域仅含有第一信号，而且选择的肿瘤类型为实体瘤，最终的临床结果都不太理想。在2008年，FredHutchison肿瘤研究所等机构使用CAR-T对B细胞淋巴瘤来进行治疗，虽然治疗结果不太理想，但这一临床实验的关键在于证实了以表达CD20的B细胞作为靶点的CAR-T治疗是相对安全的。随后，在2010年NCI报道了一例B细胞淋巴瘤治疗成功的病例，利用针对CD19的CAR-T，病人的淋巴瘤得到控制，正常B细胞也被清除，血清Ig显著降低，为CAR-T治疗B细胞来源的淋巴瘤的有效性提供了理论和实际的支持。在2011年，美国宾夕法尼亚大学的的CarlJune博士领导的团队将特异性识别CD19的CAR-T用于B细胞来源的慢性淋巴细胞白血病的治疗，显示了“治愈”的疗效，随后在复发难治性急性淋巴细胞白血病展开临床实验，也取得了良好的疗效。由于这一突破性的进展以及其他免疫调控手段的发展，Science杂志将肿瘤免疫治疗评为了2013年科技突破进展的第一名。这一成功在世界各国引起了广泛的影响，各国开始大量开展基于CAR-T的科学研究和肿瘤治疗的临床试验。CAR的结构由胞外抗原识别结构域，胞外铰链区，跨膜区和胞内的信号传导结构域组成。胞外的抗原识别域通常是由单链抗体组成，特异性识别肿瘤细胞膜表面分子，也可以是某些肿瘤特异抗原的配体或受体等。胞外铰链区是一段用于隔开抗原识别域和跨膜区的空间结构，其目的是为了提供合适的空间位置，使得胞外抗原识别域能够在识别抗原前后维持正确的结构并传导胞内信号。跨膜区是为了保证CAR分子在膜表面定位的结构域。胞内信号传导结构域是介导CAR信号传导的关键部分，通常是一个或几个第一信号(TCR和MHC-I-peptide复合物识别)，第二信号(共刺激受体和共刺激配体识别)的组合。第一代CAR只含有第一信号，第二代CAR有一个第一信号和一个第二信号，第三代CAR有一个第一信号和两个第二信号结构域。虽然CAR-T在针对B细胞来源的白血病治疗中获得了巨大的成功，但是其相对较高的复发率以及对实体瘤的低有效率是当前的重要挑战。因此发展新一代的高效CAR-T是目前临床所急需的。除了第三代CAR-T，目前还有其他新的CAR-T设计策略，即在第二代CAR-T的基础上引入了新的独立于CAR的调节分子，以进一步增强CAR-T的功能。利用病人自体血液细胞制备的针对B细胞表面靶向分子CD19、CD20的CAR-T在B细胞白血病治疗中的应用已相对成熟，但虽然响应率高，但是存在大量的复发现象，此外对实体淋巴瘤的治疗效率相对较低，这与实体肿瘤中的免疫抑制微环境有关。在实体肿瘤中，存在多种免疫细胞、肿瘤细胞和基质细胞，共同组成肿瘤微环境。肿瘤微环境通常是免疫抑制的，能够对内源的抗肿瘤T细胞反应或过继性的T细胞(譬如CAR-T)在多种层次进行抑制，譬如，导致T细胞发生耗竭，失去杀伤肿瘤的功能，最终T细胞被清除。如何增强CAR-T在实体瘤中的活化能力，使其能够对抗肿瘤微环境中的免疫抑制，是扩增CAR-T到实体瘤治疗的重要思路和方向。而当前临床使用的CAR-T结构域，在肿瘤杀伤能力和扩增能力上还存在不足，在控制实体肿瘤/转移肿瘤上疗效较差，部分CAR-T采用新型调控分子如IL-12，4-1BBL等，这些分子除了影响CAR-T，也会对其他非CAR-T细胞产生非特异的活化作用，有造成免疫副作用的潜在可能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种第三信号受体的嵌合抗原受体及其应用，并提供一种由如该嵌合抗原受体的重组表达载体构建的CAR-T细胞，在该CAR-T细胞中T细胞的活化受到第1信号(TCR和MHC-I-peptide复合物识别)，第2信号(共刺激受体和共刺激配体识别)和第3信号(细胞因子受体和细胞因子识别)的调控，这三者协同作用达到T细胞大量扩增，发挥效应功能，清除感染或肿瘤。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的结构为scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN；其中，X包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体；Y为共刺激受体的胞内区，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226；M为gammachain家族细胞因子受体的胞内区，所述细胞因子受体选自IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Ra；N为IL2Rg胞内区。为了进一步优化上述嵌合抗原受体，本专利技术采取的技术措施还包括：进一步地，所述X选自anti-CD19抗体、anti-CD20抗体、EGFR抗体、HER2抗体、EGFRVIII抗体、anti-PSMA抗体、anti-BCMA抗体、anti-CD22抗体，anti-CD30抗体。可理解的是，X还可为能与肿瘤特异结合的其他蛋白。进一步地，所述X为anti-CD20抗体，所述Y为4-1BB胞内区，所述M选自IL2Rb胞内区、IL4Ra胞内区、IL7Ra胞内区、IL9Ra胞内区、IL21Ra胞内区中的一种。进一步地，所述scFv(X)-(Y)CD3zeta为scFv-antihCD20-20BBZ，其序列如SEQIDNo.1所示；所述IL7Ra胞内区的序列如SEQIDNo.2所示；所述IL2Rb胞内区的序列如SEQIDNo.3所示；所述IL4Ra胞内区的序列如SEQIDNo.4所示；所述IL9Ra胞内区的序列如SEQIDNo.5所示；所述IL21Ra胞内区的序列如SEQIDNo.6所示；所述IL2Rg胞内区的序列如SEQIDNo.7所示。其中上述各序列具体如下：SEQIDNo.1：QIV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构为scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN；/n其中，X包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体；/nY为共刺激受体的胞内区，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226；/nM为gamma chain家族细胞因子受体的胞内区，所述细胞因子受体选自IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Ra；/nN为IL2Rg胞内区。/n

【技术特征摘要】
1.一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构为scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN；
其中，X包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体；
Y为共刺激受体的胞内区，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226；
M为gammachain家族细胞因子受体的胞内区，所述细胞因子受体选自IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Ra；
N为IL2Rg胞内区。


2.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述X选自anti-CD19抗体、anti-CD20抗体、EGFR抗体、HER2抗体、EGFRVIII抗体、anti-PSMA抗体、anti-BCMA抗体、anti-CD22抗体、anti-CD30抗体。


3.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述X为anti-CD20抗体，所述Y为4-1BB胞内区，所述M选自IL2Rb胞内区、IL4Ra胞内区、IL7Ra胞内区、IL9Ra胞内区、IL21Ra胞内区中的一种。


4.根据权利要求3所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv(X)-(Y)CD3zeta为scFv-antihCD20-20BBZ，其序列如SEQIDNo.1所示；所述IL7Ra胞内区的序列如SEQIDNo.2所示；所述IL2Rb胞内区的序列如SEQIDNo.3所示；所述IL4Ra胞内区的序列如SEQIDNo.4所示；所述IL9Ra胞内区的序列如SEQIDNo.5所示；所述IL21Ra胞内区的序列如SEQIDNo.6所示；所述IL2Rg胞内区的序列如SEQIDNo.7所示。


5.一种由如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨选明，傅阳心，汪鑫，叶圣勤，李民，
申请(专利权)人：上海隆耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31