一种全人源化EGFRvIII嵌合抗原受体T细胞及其制备方法技术

一种全人源化EGFRvIII CART细胞及其制备方法，所述T细胞表面表达全人源化EGFRvIII CAR基因，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术还包括全人源化EGFRvIII CART的制备方法。本发明专利技术的优点在于利用全人源化139抗体序列设计构建了3代全人源化EGFRvIII CART的结构，进行了细胞实验和动物实验，皆证明有效,能够活化人T细胞，是目前最新的针对EGFRvIII靶点的CART设计，能够用于人体肿瘤的治疗。

Human fully humanized EGFRvIII chimeric antigen receptor T cell and preparation method thereof

A fully humanized EGFRvIII CART cell and its preparation method, the humanized EGFRvIII expression of CAR gene in the T cell surface, its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:3. The preparation method of the invention includes the humanized EGFRvIII CART. The invention has the advantages of using the humanized antibody 139 sequence design construction of the 3 generation of humanized EGFRvIII CART, the cell and animal experiments, have proved effective, can activate T cells, is the latest to target the EGFRvIII CART design, can be used for the treatment of the human body tumor.

【技术实现步骤摘要】
一种全人源化EGFRvIII嵌合抗原受体T细胞及其制备方法
本专利技术涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法，具体涉及一种全人源化EGFRvIIICART细胞及其制备方法。
技术介绍
据《2011年中国肿瘤登记年报》报道，脑瘤或中枢神经系统肿瘤是死亡率排名第十位的恶性肿瘤。脑瘤内恶性程度较高的为胶质母细胞瘤，约占胶质瘤一半的比例。当前，胶质母细胞瘤的治疗方式主要是手术、放疗和化疗，存在着治愈率低、药物副作用大和复发率高等问题，至今仍没有有效的治疗手段，使得患者生存时间通常少于2年。近年来，随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫治疗作为一种新的治疗手段，主要通过人为干预来调动机体自身免疫系统，对癌细胞进行杀灭的作用日益受到重视。目前，最热门、最有效的免疫治疗手段包括免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorTcells，CART)。其中，免疫检查点抑制剂包括针对CTLA4、PD1、PDL1等免疫抑制分子的抗体，已被美国FDA批准用于黑色素瘤、肺癌等的治疗(中国国内正在进行临床试验)；CART在治疗白血病和淋巴瘤时，显示了巨大的优势，对于儿童复发、难治白血病，临床数据达到了93％的完全缓解率(CR)。天然状况下，由免疫反应(病毒、肿瘤抗原)活化的T细胞在识别、杀死靶细胞时，主要受到两种信号的刺激，一个为第一信号，来自T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)和CD3分子复合体，另一个为协同刺激信号，来自协同刺激分子CD28、4-1BB。T细胞只有受到这两种信号刺激时，才能充分活化，发挥杀伤功能。但是，许多肿瘤细胞会通过下调TCR分子识别的MHC-抗原肽复合物，或者下调共刺激分子，使T细胞不能发挥杀伤功能，从而逃避免疫系统的攻击，影响其治疗效果。CART是基因工程改造的T细胞，是近年来发展的靶向免疫治疗新策略，CAR分子一端为抗体的抗原识别区(单链抗体scFv)，另一端为胞内区，活化T细胞。不同代数CART的胞内区不同，最早的第一代CART只有CD3分子的胞内区，不能充分增殖，临床效果不好；第二代CART胞内区为协同刺激分子CD28+CD3ζ或4-1BB+CD3ζ，能够传递T细胞活化的两种信号，在2011年临床试验治疗白血病时显示了神奇的效果，能够清除所有白血病细胞，达到完全治愈肿瘤的目的；第三代CART中加入了两种协同刺激分子CD28和4-1BB分子，连同CD3ζ分子，能提供T细胞更多的活化信号，赋予T细胞更强的增殖性、持久的生命力，特异性地识别靶向性杀伤肿瘤细胞，尚未在临床应用。理想的肿瘤抗原应该是在正常组织中不表达或极少表达，在肿瘤组织的细胞中表达率高，它为肿瘤细胞生长过程中所必须的，避免肿瘤细胞通过不表达该抗原而逃避免疫监视。表皮生长因子受体III突变体(EGFRvIII)为表皮生长因子受体(EGFR)基因的突变体，EGFRvIII主要表达于胶质母细胞瘤内，EGFRvIII常与EGFR基因扩增同时存在，EGFR和EGFRvIII的表达见表1。表1-EGFR和EGFRvIII在不同肿瘤组织的表达肿瘤类型EGFR高表达比例EGFRvIII高表达比例胶质母细胞瘤40-63％24-64％头颈癌43-100％42-48％非小细胞肺癌32-84％0-5％乳腺癌14-91％27-36％结直肠癌25-77％0％胰腺癌30-95％无数据相比EGFR，EGFRvIII主要为EGFR胞外区的外显子2-7缺失，但是剩余基因的阅读框没有改变，能够继续转录、翻译出EGFR外显子8后面的氨基酸，由此形成肿瘤特异性表位，其胞内区能够传递信号，导致细胞向恶性转化，EGFRvIII特异性表达于肿瘤细胞内，正常组织没有表达，因此EGFRvIII是较好的肿瘤免疫治疗的靶点。细胞学方面的实验表明EGFRvIII促进细胞增殖、浸润，抵抗凋亡，使肿瘤细胞对放疗及一些化疗药物具有抵抗性，与肿瘤的发生、发展有密切关系。EGFRvIII在人类肺鳞癌标本内，有5％的检出率；EGFRvIII基因在小鼠肺组织内表达能够导致肿瘤，表明EGFRvIII过表达能够促进肿瘤发生，过表达EGFRvIII的胶质母细胞瘤细胞对通常的EGFR抑制剂治疗无效，恶性程度较高。临床试验以EGFRvIII特异肽段增强的DC细胞回输患者，可将患者中位生存时间从63.3周提高到110.8周。2013年，SampsonJ.H.构建了针对EGFRvIII的3代CART细胞，与放疗配合，在动物实验中能够有效的清除胶质瘤细胞。然而，SampsonJ.H尽管使用了3代CART结构，但是其使用的识别EGFRvIII的抗体序列为鼠源的，活化T细胞的分子也是鼠源的，使得构建的3代CART结构只能活化小鼠T细胞，不能够活化人T细胞。现有技术CN201480009507.1公开了使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症中主要用到是小鼠抗体序列3C10，而选用139抗体序列只做了2代CAR，没有做动物实验。因此，全人源化EGFRvIIICART细胞关键之处在于设计全人源识别EGFRvIII的scFV序列使用在3代CART结构，证明此种设计能够使CART细胞具有杀伤EGFRvIII表达细胞的功能，通过细胞实验和动物实验均证明有效才可行。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，一种全人源化EGFRvIIICART细胞，所述T细胞表面表达全人源化EGFRvIIICAR基因，其碱基序列如SEQIDNO:3所示。进一步，所述全人源化EGFRvIIICAR基因是由合成的ScFV基因和合成的3代CAR结构基因通过重叠PCR进行拼接。进一步，所述合成的ScFV基因包括编码CD8信号肽的核苷酸+全人源化139抗体的轻链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸+编码linker(G4S)3+全人源化139抗体的重链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。进一步，所述合成的3代CAR结构基因包括编码CD8铰链区+CD28跨膜区、胞浆区+4-1BB胞浆区+CD3ζ胞浆区的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种全人源化EGFRvIIICART细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)构建3代慢病毒CAR载体：首先将合成的ScFV基因或合成的3代CAR结构基因分别扩增PCR，得到合成的ScFV基因片段的PCR产物和合成的3代CAR结构基因片段的PCR产物；然后进行重叠PCR将这两个基因片段的PCR产物连接在一起，得到3代CAR结构的EGFRvIIICAR基因；最后将Pre-Lenti-EF1-MCS载体和EGFRvIIICAR基因双酶切，连接，转化，提质粒，测序，得到序列正确的表达EGFRvIIICAR的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR；(2)包装EGFRvIIICAR慢病毒，感染T细胞，制备得到CART进行细胞杀伤实验验证，证明有效；(3)再次制备EGFRvIIICART，进行动物实验功能验证，证明有效。进一步，步骤(1)中，用于所述扩增PCR的引物为EGFRvIII-EcoRI-up序列如SEQIDNO:4所示和EGFRvIII-BamHI-down序列如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全人源化EGFRvIII CART细胞，其特征在于，所述T细胞表面表达全人源化EGFRvIII CAR基因，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种全人源化EGFRvIIICART细胞，其特征在于，所述T细胞表面表达全人源化EGFRvIIICAR基因，其碱基序列如SEQIDNO:3所示。2.根据权利要求1所述的全人源化EGFRvIIICART细胞，其特征在于，所述全人源化EGFRvIIICAR基因是由合成的ScFV基因和合成的3代CAR结构基因通过重叠PCR进行拼接。3.根据权利要求2所述的全人源化EGFRvIIICART细胞，其特征在于，所述合成的ScFV基因包括编码CD8信号肽的核苷酸+全人源化139抗体的轻链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸+编码linker(G4S)3的核苷酸+全人源化139抗体的重链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。4.根据权利要求2所述的全人源化EGFRvIIICART细胞，其特征在于，所述合成的3代CAR结构基因包括编码CD8铰链区+CD28跨膜区、胞浆区+4-1BB胞浆区+CD3ζ胞浆区的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。5.一种如权利要求1-4之一所述的全人源化EGFRvIIICART细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建3代慢病毒CAR载体：首先将合成的ScFV基因或合成的3代CAR结构基因分别扩增PCR，得到合成的ScFV基因片段的PCR产物和合成的3代CAR结构基因片段的PCR产物；然后进行重叠PCR将这两个基因片段的PCR产物连接在一起，得到3代CAR结构的...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗红建，何昱，余祥，姜冬冬，孟邑芳，
申请(专利权)人：北京普瑞金科技有限公司，普瑞金深圳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11