本发明专利技术涉及小鼠白血病细胞L615在制备HIV‑1可感染的宿主细胞中的应用，还涉及一种HIV‑1可感染的宿主细胞，其为细胞表面上表达有CD4和CCR5并且细胞内表达有Cyclin T1的小鼠白血病细胞L615。本发明专利技术还涉及所述HIV‑1可感染的宿主细胞的制备方法和应用。本发明专利技术得到的HIV‑1可感染的宿主细胞可被HIV‑1高效地感染，并且受感染的细胞中所复制的病毒颗粒具有感染活性，受感染的细胞可向细胞外分泌有活性的HIV‑1病毒。因此，本发明专利技术的HIV‑1可感染的宿主细胞可用于HIV‑1感染的治疗和研究，以及制备抗HIV‑1药物研制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及HIV治疗与研究领域，更特别地，涉及一种HIV-1可感染的宿主细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)是一种感染人类免疫系统细胞、导致获得性免疫缺陷综合症(Acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)的慢病毒。HIV分为1型和2型，1型是目前全球流行的主要毒株，用HIV-1表示。HIV-1对宿主细胞具有高度选择性，仅能感染人类和少数灵长类动物(如猩猩、长臂猿等)。常见的猴类如恒河猴、猕猴等动物在正常状态下是无法感染HIV-1。目前，HIV-1的感染研究模型，主要有细胞模型和动物模型两种。细胞模型主要是一些CD4阳性细胞，如T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。这些细胞表面带有CD4分子(也就是HIV-1受体)，HIV-1的囊膜蛋白gp120能与这些CD4分子结合，使得gp41暴露出来；暴露后的gp41与细胞上的协同受体CXCR4或CCR5结合而介导HIV-1进入这些细胞内实现感染；通过研究HIV-1在宿主细胞内的逆转录和复制情况，进而进行抗HIV-1病毒药物等研究。然而，T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等CD4阳性细胞在人体存在的数量较少，且分离困难。动物模型也是基于HIV-1细胞模型的基础而实现，主要有非人灵长类动物模型、嵌合体鼠感染HIV动物模型等。针对人类组织来源的HIV-1宿主细胞研究，可以在人类来源组织细胞的表面加载CD4分子及协同受体CXCR4或CCR5分子来建立HIV-1感染的细胞模型，如TZM-bl细胞系，就是基于人宫颈癌HeLa细胞，通过植入CD4和CCR5基因，使细胞膜表面高强度的表达CD4和CCR5分子，改造成的TZM-bl细胞对不同群簇的HIV-1具有高度易感染性。另外，可以通过对人类CD4阳性T白血病细胞系的筛选等工作，目前已发现CEM、Jurkat、Hut78、以及HTLV-1感染的MT-2和MT-4等细胞系，可以被HIV-1分离株病毒感染，被应用于HIV-1的病理机制、抗病毒药物的体外筛选、疫苗研究等。然而，非人源的HIV-1宿主细胞，特别是小型动物来源的细胞，因为HIV-1对种簇的特异性，进展上一直存在很大的障碍，例如GM95细胞，一种基于鼠黑色素瘤细胞，应用逆转录病毒整合CD4、CXCR4和CCR5基因后进行转录，使其细胞膜上表达CD4、CXCR4和CCR5分子，可以实现HIV-1的感染，却难于维续病毒的完整复制，仅仅可以应用于HIV-1的入胞感染研究。研究一种小型动物来源细胞的HIV-1宿主细胞，对于HIV-1易感小型动物模型研究具有现实性意义。
技术实现思路
L615细胞是一种小鼠白血病细胞，由我国中国科学院血液病研究所在20世纪60、70年代通过小鼠白血病病毒诱导而建立的一株网织细胞型白血病细胞模型。L615细胞作为一种鼠类血细胞的未分化细胞，在细胞培养上简便成熟，当L615细胞进行鼠类动物移植时，不管是应用尾静脉注射、皮下注射、还是腹腔注射，均可以在血液中达到一个理想的L615细胞稳定含量，常常用于复制白血病的鼠类动物模型。然而，L615细胞却不能作为HIV-1感染的宿主细胞，因为其细胞膜上不仅缺乏HIV-1感染的受体与辅助受体分子，还缺乏HIV-1复制的基本条件。然而，出乎意料的是，当专利技术人将人源的CD4、CCR5和CyclinT1基因植入L615细胞并使这些基因在其中表达后，发现所得到遗传改造的细胞具有可被HIV-1病毒感染的特性，并且HIV-1病毒在该细胞中具备完整的病毒复制的特性，由此制备出一种能够跨种簇感染HIV-1的鼠类宿主细胞模型。基于以上工作，本专利技术提供了小鼠白血病细胞L615在制备HIV-1可感染的宿主细胞中的应用。本专利技术还提供了一种HIV-1可感染的宿主细胞，其特征在于，为细胞表面上表达有CD4和CCR5并且细胞内表达有CyclinT1的小鼠白血病细胞L615。优选地，通过向所述小鼠白血病细胞L615中导入带有CD4基因表达框、CCR5基因表达框和CyclinT1基因表达框的重组载体，然后筛选所述CD4基因、CCR5基因和CyclinT1基因都表达的细胞即得到所述HIV-1可感染的宿主细胞。本专利技术还提供了一种制备上述HIV-1可感染的宿主细胞的方法，其特征在于，包括将带有CD4基因表达框、CCR5基因表达框和CyclinT1基因表达框的重组表达载体导入所述小鼠白血病细胞L615中的步骤。优选地，所述CD4基因表达框、CCR5基因表达框和CyclinT1基因表达框位于同一重组表达载体上，所述重组表达载体为慢病毒质粒载体。优选地，所述重组表达载体通过将序列如SEQIDNO:1所示的CMV-CD4-T2A-CyclinT1-IRES/CCR5插入到慢病毒质粒骨架中得到。优选地，所述CD4基因、CCR5基因和CyclinT1基因表达的筛选通过RT-PCR、免疫印迹法进行。本专利技术还提供了所述HIV-1可感染的宿主细胞在研究HIV发病机制中的应用。本专利技术还提供了所述HIV-1可感染的宿主细胞在抗病毒药物研制中的应用。本专利技术得到的HIV-1可感染的宿主细胞可被HIV-1高效地感染，并且受感染的细胞中所复制的病毒颗粒具有感染活性，受感染的细胞可向细胞外分泌有活性的HIV-1病毒。因此，本专利技术的HIV-1可感染的宿主细胞可用于HIV-1感染的治疗和研究，以及抗HIV-1药物研制。附图说明图1为带有hCD4/CCR5/CyclinT1表达框的慢病毒质粒结构示意图；图2为hCD4/CCR5的mRNA的实时荧光定量PCR统计图；图3为hCD4/CCR5mRNA凝胶电泳照片；图4为CyclinT1mRNA实时荧光定量PCR统计图；图5为hCD4/CCR5蛋白免疫印迹照片；图6为hCD4/CCR5分子免疫成像检测结果；图7为hCD4/CCR5/CyclinT1转染L615细胞于HIV-1感染后细胞内HIV-1RNA的PCR结果统计图；图8为hCD4/CCR5/CyclinT1转染L615细胞于HIV-1感染后培养上清中HIV-1RNA的PCR结果统计图；图9为L615细胞于HIV-1感染后培养上清液对CEM细胞感染性的HIV-1RNA的PCR检测结果统计图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.HIV-1可感染的宿主细胞的制备1)慢病毒表达载体的构建目的基因分别为hCD4(GenBank序列号：NM_000616.4)、hCCR5(GenBank序列号：NM_000579.3)和humanCyclinT1(GenBank序列号：NM_001240.3)构建成双启动子慢病毒过表达载体，从国际标准基因库调取，采用双顺反子载体(Bicistronic)的表达方式，制备慢病毒包装载体。本慢病毒载体的结构示意图见图1。采用Gateway技术，首先构建pDown-CD4-T2A-CyclinT1、pUP-CMV、pTail-IRES/CCR5；小量提取质粒pDown-CD4-T2A-CyclinT1和骨架载体，25℃，LR反应3h，反应体系为pUP本文档来自技高网...
【技术保护点】
小鼠白血病细胞L615在制备HIV‑1可感染的宿主细胞中的应用。
【技术特征摘要】
1.小鼠白血病细胞L615在制备HIV-1可感染的宿主细胞中的应用。2.一种HIV-1可感染的宿主细胞，其特征在于，为细胞表面上表达有CD4和CCR5并且细胞内表达有CyclinT1的小鼠白血病细胞L615。3.根据权利要求2所述的HIV-1可感染的宿主细胞，其特征在于，通过向所述小鼠白血病细胞L615中导入带有CD4基因表达框、CCR5基因表达框和CyclinT1基因表达框的重组载体，然后筛选所述CD4基因、CCR5基因和CyclinT1基因都表达的细胞即得到所述HIV-1可感染的宿主细胞。4.一种制备如权利要求3所述的HIV-1可感染的宿主细胞的方法，其特征在于，包括将带有CD4基因表达框、CCR5基因表达框和CyclinT1基因表达框的重组表达载体导入所述小鼠白血...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾常春，李雅婧，李丽君，何金洋，
申请(专利权)人：深圳市龙华新区中心医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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