重组间充质干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了重组间充质干细胞及其制备方法。通过在间充质干细胞中转染用于表达P选择素糖蛋白配体-1的第一信使RNA、用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原的第二信使RNA和用于表达白介素-10的第三信使RNA，得到重组间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组间充质干细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
免疫性疾病(immunediseases)是指免疫调节失去平衡，影响机体的免疫应答而引起的疾病。广义的免疫性疾病包括先天或后天性原因导致的免疫系统结构上或功能上的异常。其中多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种常见的由自身免疫反应介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。病灶多发于脑和脊髓的白质，呈多灶性炎性细胞侵润、脱髓鞘及神经元损伤，可导致感觉、运动、意识和神经认知等多方面的功能障碍。该病多发于20～40岁的青壮年人，复发率和致残率高，是青壮年人非外伤性神经残疾最常见的原因，迄今为止还无法完全治愈。其中用间充质干细胞(Mesenchymalstemcell，MSCs)移植治疗多发性硬化(multiplesclerosis，MS)、炎症性肠病，类风湿性关节炎等免疫炎症性疾病，取得了显著治疗效。间充质干细是指具有自我更新能力、并能分化为骨，软骨和脂肪细胞的一组中胚层来源的细胞群。近年来许多学者发现MSCs不仅具有多向分化能力，而且MSCs还能很有效地调节免疫系统的功能，正因为如此，MSCs对于自身免疫性和炎症相关的疾病具有广阔的治疗应用前景。目前静脉移植干细胞是最为常用和安全方便的移植途径，但是，静脉移植间充质干细胞后，由于MSCs归巢到疾病或炎症损伤部位的效率低下，以及即使少量的MSCs在达到疾病部位后，其分泌的抗炎症分子的不可控性，大大地影响了MSCs治疗免疫炎症性疾病的效率。这也是为什么在当今已经完成或还在进行中的数百项临床试验的结果往往得出了阴性的结果。因此，如何开发出针对于增加MSCs归巢到疾病或炎症损伤的部位和如何提高MSCs在疾病部位分泌抗炎症分子的能力的有效方法，将对促进MSCs在临床上的应用具有重要的意义。综上所述，传统的间充质干细胞归巢到疾病或炎症损伤部位效率较低、分泌抗炎症分子的能力较低。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种归巢到疾病或炎症损伤部位效率较高、分泌抗炎症分子的能力较高的重组间充质干细胞及其制备方法和应用。一种重组间充质干细胞，所述重组间充质干细胞中转染了第一信使RNA、第二信使RNA和第三信使RNA；所述第一信使RNA用于表达P选择素糖蛋白配体-1，所述第二信使RNA用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原，所述第三信使RNA用于表达白介素-10。一种重组间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：提供第一信使RNA、第二信使RNA和第三信使RNA，所述第一信使RNA用于表达P选择素糖蛋白配体-1，所述第二信使RNA用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原，所述第三信使RNA用于表达白介素-10；提供间充质干细胞，所述间充质干细胞培养在细胞培养液中；以及将转染试剂、所述第一信使RNA、所述第二信使RNA和所述第三信使RNA加入所述培养所述间充质干细胞的所述细胞培养液中进行基因转染，得到所述重组间充质干细胞。一种药物的靶向载体，所述靶向载体中包括上述任一项所述的重组间充质干细胞。上述重组间充质干细胞，通过在间充质干细胞中转染用于表达P选择素糖蛋白配体-1(P-selectinglycoproteinligand1，PSGL-1)的第一信使RNA、用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原(SialylLewis-X，SLeX)的第二信使RNA和用于表达白介素-10(Interleukin-10，IL-10)的第三信使RNA，得到重组间充质干细胞。实验结果表明，该重组间充质干细胞可表达分泌PSGL-1、SLeX和IL-10，分泌抗炎症分子的能力较高。归巢促进因子PSGL-1以及SLeX可显著提高重组间充质干细胞靶向归巢到疾病或炎症损伤部位的效率，结合抗炎因子IL-10，可增加重组间充质干细胞的炎症抑制能力。附图说明图1为一实施方式的重组间充质干细胞的制备方法的流程图；图2a为免疫荧光检测重组间充质干细胞的PSGL-1的表达量的结果图；图2b为免疫荧光检测重组间充质干细胞的SLeX的表达量的结果图；图2c为Elisa检测重组间充质干细胞上清中的IL-10的表达量的结果图；图3为流式细胞仪检测重组间充质干细胞抑制T淋巴细胞的增殖情况的结果图；图4a为流动腔1dyn/cm2条件下检测转染了PSGL-1和SLeX的重组间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4b为流动腔1dyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4c为流动腔1dyn/cm2条件下检测HL-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4d为流动腔2dyn/cm2条件下检测转染了PSGL-1和SLeX的重组间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4e为流动腔2dyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4f为流动腔2dyn/cm2条件下检测HL-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4g为流动腔5dyn/cm2条件下检测下转染了PSGL-1和SLeX的重组间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4h为流动腔5dyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4i为流动腔5dyn/cm2条件下检测HL-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4j为流动腔10dyn/cm2条件下检测转染了PSGL-1和SLeX的重组间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4k为流动腔10dyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4l为流动腔10dyn/cm2条件下检测HL-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果图；图4m为图4a～图4l的统计结果图；图5a为荧光显微镜检测重组间充质干细胞归巢到脊髓中的细胞数量的结果图；图5b为荧光显微镜检测未转染的间充质干细胞归巢到脊髓中的细胞数量的结果图；图5c为图5a和图5b的统计结果图；图6为重组间充质干细胞移植的MS动物模型的临床症状评分的结果图；图7为免疫荧光检测重组间充质干细胞移植的EAE动物模型的炎症程度的结果图；图8为Lxuol速蓝染色检测重组间充质干细胞移植的EAE动物模型的脊髓的脱髓鞘程度的结果图。具体实施方式下面主要结合附图及具体实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组间充质干细胞，其特征在于，所述重组间充质干细胞中转染了第一信使RNA、第二信使RNA和第三信使RNA；所述第一信使RNA用于表达P选择素糖蛋白配体‑1，所述第二信使RNA用于表达唾液酸化路易斯寡糖‑X抗原，所述第三信使RNA用于表达白介素‑10。

【技术特征摘要】
1.一种重组间充质干细胞，其特征在于，所述重组间充质干细胞中转染
了第一信使RNA、第二信使RNA和第三信使RNA；
所述第一信使RNA用于表达P选择素糖蛋白配体-1，所述第二信使RNA
用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原，所述第三信使RNA用于表达白介素
-10。
2.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于，所述第一信
使RNA的基因序列包括：(a)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；(b)、与SEQ
IDNo.1所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列；或(c)、SEQ
IDNo.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的
核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于，所述第二信
使RNA的基因序列包括：(a)、SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；(b)、与SEQ
IDNo.2所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列；或(c)、SEQ
IDNo.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的
核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于，所述第三信
使RNA的基因序列包括：(a)、SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；(b)、与SEQ
IDNo.3所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列；或(c)、SEQ
IDNo.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的
核苷酸序列。
5.一种重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供第一信使RNA、第二信使RNA和第三信使RNA，所述第一信使RNA
用于表达P选择素糖蛋白配体-1，所述第二信使RNA用于表达唾液酸化路易
斯寡糖-X抗原，所述第三信使RNA用于表达白介素-10；
提供间充质干细胞，所述间充质干细胞培养在细胞培养液中；以及
将转染试剂、所述第一信使RNA、所述第二信使RNA和所述第三信使

\tRNA加入所述培养所述间充质干细胞的所述细胞培养液中进行基因转染，得
到所述重组间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，
还包括在进行所述基因转染之前0.5h～2h，更换培养所述间充质干细胞的细胞
培养液。
7.根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，
还包括在进行所述基因转染之前，提供减血清细胞培养液，将所述第一信使
RNA、所述第二信使RNA和所述第三信使RNA与所述减血清细胞培养液混
匀；
所述第一信使RNA与所述减血清细胞培养液的质量体积比为
0.01μg/μL～1μg/μL，所述第二信使RNA与所述减血清细胞培养液的质量体积
比为0.01μg/μL～1μg/μL，所述第三信使RNA与所述减血清细胞培养液的质量
体积比为0.01μg/μL～1μg/μL。
8.根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，
所述第一信使RNA的加入量与所述间充质干细胞的细胞密度的比值为
0.01μg/cm2～...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44