本发明专利技术涉及利用人造血干细胞制备巨核细胞及血小板的方法和体系。本发明专利技术的技术方案可使得CD34+干细胞在保持原来干性特征的基础上进行有效和大量的扩增，并进一步采用定向分化的技术制备成熟的巨核细胞，用于生产血小板。本发明专利技术的技术方案可解决血小板用于疾病的移植治疗和科研的来源问题，可为国防提供血液成分细胞的战略储备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域；更具体地，本专利技术涉及利用人造血干细胞制备巨核细 胞及血小板的方法和体系。
技术介绍
造血干细胞化emopoietic stem cell)是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细 胞和免疫细胞的起源，因此是多功能干细胞，主要存在于骨髓、外周血、厮带血中。送些细胞 能够向髓系和淋己系祖细胞分化，其中髓系包括红细胞，粒细胞、单核细胞和巨核细胞各系 等。 巨核细胞系统包括原始巨核细胞、幼稚巨核细胞W及巨核细胞和血小板。造血干 细胞分化后的巨核细胞细胞质中会出现紫红色颗粒和血小板，当血小板发育成熟后，会从 胞浆脱离巨核细胞，直至巨核细胞只剩下一个细胞核，不再继续产生血小板。巨核细胞/血 小板的生成障碍会在临床上表现为特发性血小板减少性紫薇、结缔组织病、脾功能亢进、巨 幼细胞性贫血等疾病。 目前，利用优化的扩增因子组合可W对人造血干细胞进行高效扩增（参见一种高 效离体人造血干细胞扩增培养液配方，201410066590. 8)，在此基础上，如开发出诱导分化 技术对扩增后的造血干细胞进行巨核细胞系的定向分化，解决人造血干细胞来源的血小板 数量的问题，则可应用于血小板功能研究及通用的细胞制剂开发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供利用人造血干细胞制备巨核细胞及血小板的方法和体系。 在本专利技术的第一方面，提供一种制备人巨核细胞的方法（为非治疗性方法），所述 方法包括： (1)利用造血干细胞扩增培养基扩增CD34+干细胞（来源于人造血干细胞）； (2)将步骤（1)扩增后的细胞转移到巨核细胞诱导分化培养基中培养，获得人巨 核细胞； 其中，所述的造血干细胞扩增培养基包括；干细胞基础培养基、按照体积比 0. 01-0. 1% DMS0 W及如下组分： 干细胞因子（SCF) ;50-500ng/mL ; Flt3-配体（FLT-3L) ;50-500ng/mL ;[001引血小板因子灯P0) ;5-200ng/mL ; 白介素3(比-3) ; 10-250ng/mL ; Sail样蛋白4B(Sall4B) :l-10ng/mL ;和 造血干细胞扩增剂StemRegenin-1 (SRI) ;0. 5-3 μ Μ ; 其中，所述的巨核细胞诱导分化培养基包括；干细胞基础培养基W及如下组分： 干细胞因子（SC巧；50-500ng/mL ;[001引血小板因子（ΤΡΟ);5-200ng/mL ;白介素3(比-3) ; 10-250ng/mL ;白介素 6(比-6) ;5-100ng/mL ;白介素11(比-11) ;5-100ng/mL ;[002引粒细胞巨瞻细胞刺激因子（GM-CS巧：5-50ng/ml ;和低密度脂蛋白（LDL) ;5-50ug/ml。 在一个优选例中，所述的干细胞基础培养基选自（但不限于）；StemSpan培养基或 者Modified IMDM培养基（较佳地其中无血清）。 在另一优选例中，步骤（1)包括；CD34+干细胞加入到所述的造血干细胞扩增培养 基中，使得细胞浓度为0. 5X104-10X104个细胞/mL个细胞/mL(较佳地为1X104-8X1〇4 个细胞/mL);培养2-4天后根据细胞数目增加量添加所述的造血干细胞扩增培养基使得细 胞浓度为0. 5X104-10X104个细胞/mL(较佳地为1X104-8X104个细胞/mL);步骤（1)进 行5-7天。 在另一优选例中，步骤似包括：步骤（1)进行5-7天后，将获得的细胞转移 到所述的巨核细胞诱导分化培养基中，细胞密度为1.0X1〇5-10X1〇5个细胞/mL(较佳 地2.0X105-4.0X105个细胞/mL),继续培养2-4天后根据细胞数目增加量添加所述 的巨核细胞诱导分化培养基使得细胞浓度为l.〇Xl〇5-l〇Xl〇5个细胞/mL(较佳地为 2. 0X105-4. 0X1〇5个细胞/mL)，继续培养3-5天后收获细胞。 在另一优选例中，所述方法还包括从获得的细胞培养物中分离人巨核细胞。 在本专利技术的另一方面，提供一种用于扩增CD34+干细胞的造血干细胞扩增培养基， 其中包括；干细胞基础培养基W及如下组分：干细胞因子；50-500ng/mL ; Flt3-配体；50-500ng/mL ;血小板因子；5-200ng/mL ;白介素3 ;10-250ng/血；Sail样蛋白 4B;l-10ng/mL ;和造血干细胞扩增剂StemRegenin-1 ;0. 5-3 μ M。 在一个优选例中，所述的用于扩增CD34+干细胞的造血干细胞扩增培养基，其中包 括如下组分：干细胞因子；100-300ng/mL ; Flt3-配体；100-300ng/mL ;血小板因子；10-150ng/mL ;白介素3 ;15-150ng/mL ; Sail样蛋白 4B;2-8ng/mL ;和造血干细胞扩增剂StemRegenin-1;1-2μΜ。 在本专利技术的另一方面，提供一种用于诱导分化人巨核细胞的培养基，其中包括；干 细胞基础培养基W及如下组分：干细胞因子；50-500ng/mL ;血小板因子；5-200ng/mL ; 表皮细胞生长因子：2-2化g/mL;白介素3 ;l〇-25〇ng/血；白介素 6 ;5-100ng/mL;白介素 11 ;5-100ng/mL; 粒细胞巨瞻细胞刺激因子GM-CSF;5-5化g/ml;和 低密度脂蛋白；5-50ug/ml。 在一个优选例中，所述的用于诱导分化人巨核细胞的培养基，所述组分包括：干细胞因子；80-300ng/mL;血小板因子；3〇-150ng/mL;白介素 3 ;15-150ng/mL;白介素 6;20-80ng/mL ;白介素 11 ;15-80ng/mL; 粒细胞巨瞻细胞刺激因子GM-CSF ;15-40ng/ml;和 [005引低密度脂蛋白；15-40ug/ml。 在本专利技术的另一方面，提供所述的培养基的用途，用于制备人巨核细胞。 在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备人巨核细胞的试剂盒，所述试剂盒中包 括： (a)所述的用于扩增CD34+干细胞的造血干细胞扩增培养基；和 化）所述的用于诱导分化人巨核细胞的培养基。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。【附图说明】 图1、本专利技术对人厮血CD34+干细胞的扩增情况。A、0-6天总细胞数及CD34+细胞扩增的数目；B、0-6天总细胞数及CD34+细胞扩增的倍数。 图2、本专利技术对人厮血干细胞扩增分化为巨核细胞系的情况。[006引 A、巨核细胞系表面标记CD41和CD42的表达情况；B、CD4r细胞及CD42+细胞扩增的数目；C、CD4r细胞及CD42+细胞扩增的倍数。 图3、本专利技术对人厮血干细胞扩增分化为巨核细胞的形态学观察结果。 图4、本专利技术对人厮血干细胞扩增分化为巨核细胞的多倍体分析。 图5、本专利技术对人骨髓动员后外周血CD34+干细胞的扩增情况。A、0-6天总细胞数及CD34+细胞扩增的数目；B、0-6天总细胞数及CD34+细胞扩增的倍数。 图6、本专利技术对人骨髓动员后外周血干细胞扩增分化为巨核细胞系。A、巨核细胞系表面标记CD41和CD42的表达情况；B、CD4r细胞及CD42+细胞扩增的数目；C、C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备人巨核细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用造血干细胞扩增培养基扩增CD34+干细胞；(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到巨核细胞诱导分化培养基中培养，获得人巨核细胞；其中，所述的造血干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基、按照体积比0.01‑0.1％DMSO以及如下组分：干细胞因子：50‑500ng/mL；Flt3‑配体：50‑500ng/mL；血小板因子：5‑200ng/mL；白介素3：10‑250ng/mL；Sall样蛋白4B：1‑10ng/mL；和造血干细胞扩增剂StemRegenin‑1：0.5‑3μM；其中，所述的巨核细胞诱导分化培养基包括：干细胞基础培养基以及如下组分：干细胞因子：50‑500ng/mL；血小板因子：5‑200ng/mL；白介素3：10‑250ng/mL；白介素6：5‑100ng/mL；白介素11：5‑100ng/mL；粒细胞巨噬细胞刺激因子：5‑50ng/ml；和低密度脂蛋白：5‑50ug/ml。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋永平，关欣，秦蒙，戴卫，
申请(专利权)人：苏州方舟基因药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。