本发明专利技术涉及一种用于示踪子宫植入干细胞转归的试剂盒及其制备方法。本发明专利技术技术方案为由纳米粒子超顺磁性氧化铁纳米颗粒及近红外量子点硫化银标记脐带间充质干细胞组成。本发明专利技术克服了超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记干细胞的磁共振活体成像技术存在的成像时间长、敏感度有限，近红外量子点荧光成像技术存在的对组织穿透力有限，不能显示器官空间结构等缺陷。本发明专利技术可在体定位干细胞至术后一周，可揭示干细胞定植后的组织外转移部位。所用对比剂SPIO@SiO2和Ag2S-QDs已经细胞实验证明生物相容性好，磁共振仪器及近红外量子点荧光成像仪已有商业化产品，技术可推广程度高，技术可控，安全性好，有利于干细胞治疗严重子宫内膜损伤的科学研究，保护实验动物福利。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于妇产科学领域，具体涉及一种。
技术介绍
不孕症病因薄型内膜和宫腔粘连是辅助生殖技术发展中影响成功率的制约因素。间充质干细胞(MSCs)宫腔移植是较有希望的治疗方法，用MSCs复合胶原支架治疗大鼠子宫壁损伤，支架提供了结构性支撑和细胞粘附的基础，使大数量级细胞作为一个活体组织片直接接合到损伤组织处，目前已获得子宫损伤的解剖和功能修复。但是干细胞移植后在子宫局部定位、分化、如何转移仍不明确。外源性干细胞治疗的细胞传递途径有两种方式:通过循环系统的全身干细胞传递和局部干细胞传递，对于全身干细胞传递研究已知干细胞经体循环会分布于肺、肝、脾等多个脏器及淋巴结内，约4-10%的干细胞会归巢至损伤缺血区域；对于局部注射干细胞，则注重于干细胞存活、分布、功能方面的研究，没有局部传递方式移植干细胞的再转移研究。对于干细胞移植后在体内的监测多采用细胞体外标记示踪剂后再移植体内的方法，如:1)遗传性地改变细胞的基因，使其表达特异性的标志物，如绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶等；2)选用雄性供体和雌性宿主，利用染色体作为标志物；3)利用染料标记细胞；4)移植前用5-溴-2-脱氧尿苷或脱氧胸苷来监测正在分裂的细胞。以上方法的缺点是如监测干细胞体内的迁移必须在离体状态下进行组织切片分析，为创伤性、毁灭性方法，临床上难以应用于人体。在本专利技术之前，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SP1Ns)标记干细胞的磁共振活体成像技术是干细胞在体示踪较经典的方法，具有多功能、多序列、多参数、多方位成像以及较高的软组织分辨力。但这种方法成像时间长、敏感度有限；近红外量子点(QDs)荧光成像技术也是一种在体光学成像技术。QDs具有独特的光学特性:荧光度强，光化学稳定性好，不易发生光漂白，成像快速、敏感，但对组织穿透力有限，不能显示器官空间结构。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述缺陷，研制一种。本专利技术的技术方案是:用于示踪子宫植入干细胞转归的试剂盒，其主要技术特征在于由纳米粒子超顺磁性氧化铁纳米颗粒及近红外量子点硫化银标记脐带间充质干细胞组成。1、所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SP10@Si02)由二氧化硅(Si02)包被四氧化三铁(Fe304)晶体核心组成，平均晶体直径27±3nm，平均ζ电位+50mv ;可产生强大的Τ2负性对比增强效应。2、所述近红外量子点硫化银(Ag2S_QDs)采用单源前驱体热分解合成，颗粒粒径大小为5.4±0.3nm，激发光785nm时，可发射波长位于1000_1320nm的近红外II区荧光。3、所述脐带间充质干细胞由中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所干细胞库分离与培养，经流式细胞术细胞表面抗原鉴定:显示⑶14、⑶34和⑶45为阴性，⑶29、⑶44和⑶105为阳性，呈现为间质干细胞的特征。4、所述的严重子宫内膜损伤是指各种原因造成的子宫内膜过度损伤，内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫壁发生纤维化，瘢痕形成。本专利技术的另一技术方案是:用于示踪子宫植入干细胞转归的试剂盒的制备方法，其主要技术特征在于制备步骤如下:1)超顺磁性氧化铁纳米粒子(SP10@Si02)标记液的配制:将SP10@Si02原液置于深低温(-196°C )液氮中冷冻除菌，将浓度为lmg/ml的SP10@Si02原液加入DMEM(含氨基酸和葡萄糖的培养基)无血清培养液中稀释为lOOygFe/ml的工作标记液备用；2) SP10iSi02标记间充质干细胞:用第五代MSCs，吸出原含血清的培养液，PBS (磷酸盐缓冲液)洗涤3遍；100 μ gFe/ml SP10iSi02加入多聚左旋赖氨酸(Fe: PLL为1: 0.03)，37°C孵育1小时制成含Fe-PLL复合物的标记液，用标记液与MSCs在100%饱和湿度、5% C02、37°C细胞培养箱中孵育过夜；SP10@Si02标记MSCs孵育12h后弃去含SP100Si02的培养基，用PBS洗涤3遍，再用100U/ml的肝素钠PBS液洗涤2遍，加入4ml 0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(乙二胺四乙酸)液，37°C消化5min，加入4ml含10%胎牛血清培养基，反复吹打，移液至离心管中离心后弃上清，加入DMEM/LG完全培养液重悬MSCs ；3)近红外量子点硫化银(Ag2S_QDs)标记液的配制:将Ag2S_QDs原液置于深低温(-196°C )液氮中冷冻除菌，将0.lmg量的Ag2S-QDs原液加入DMEM无血清培养液中稀释为25 μ g/ml的工作标记液，与MSCs在37°C下孵育30min，用PBS冲洗细胞3次；4)Ag2S_QDs标记间充质干细胞:用第五代MSCs，吸出原含血清的培养液，PBS洗涤3遍，用25 μ g/ml Ag2S-QDs和Hychont培养DMEM-F12为细胞进行等量换液，在100 %饱和湿度、5% C02、37°C细胞培养箱中孵育12h过夜；Ag2S_QDs标记MSCs孵育12h后弃去含Ag2S-QDs的培养基，用PBS洗涤3遍，加入4ml0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA液，37°C消化5min，加入4ml含10%胎牛血清培养基，反复吹打，移液至离心管中离心后弃上清，加入DMEM-F12完全培养液重悬MSCs。所述胶原支架复合标记SP10@Si02或Ag2S_QDs标记的MSCs由以下方法制备:培养基湿润胶原支架后将标记SP10@Si02或Ag2S_QDs的MSCs细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，放入37°C、5% C02培养箱中培养2h，加入L-DMEM完全培养基继续培养15min。本专利技术的优点和效果在于试剂盒与传统干细胞标记方法相比采用干细胞纳米粒子双标记法示踪干细胞，与以往示踪方法相比具有以下优点:可在体定位干细胞至术后一周，可揭示干细胞定植后的组织外转移部位。所用对比剂SP10@Si02和Ag2S-QDs已经细胞实验证明生物相容性好，磁共振仪器及近红外量子点荧光成像仪已有商业化产品，技术可推广程度高，技术可控，安全性好，有利于干细胞治疗严重子宫内膜损伤的科学研究，保护实验动物福利。【附图说明】图1——不同数量级标记SP10@Si02的MSCs体外MRI信号强度检测示意图，其中A 为 1 X 104 个 /ml 标记 SP10iSi02 的 MSCs 体外 MRI，B 为 1 X 105 个 /ml 标记 SP10iSi02 的MSCs 体外 MRI，C 为 1 X 106 个 /ml 标记 SP10iSi02 的 MSCs 体外 MRI，D 为 1 X 104 个 /ml 未标记 SP10iSi02 的 MSCs 体外 MRI，E 为 1 X 105 个 /ml 未标记 SP10iSi02 的 MSCs 体外 MRI，F为 1 X 106 个 /ml 未标记 SP10iSi02 的 MSCs 体外 MRI。图2-不同数量级标记Ag2S_QDs的MSCs荧光强度检测示意图。图3——术后48小时7.0T超导小动物专用磁共振扫描仪成像_T2加权横断位子宫成像。图4——术后一周7.0Τ超导小动物专用磁共振扫描仪成像示意图-Τ2加权横断位子宫成像。图5——术后一月离体大鼠内生殖器近红外量子点荧光成像示意图.图6—普鲁士蓝染色阳性细胞在本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于示踪子宫植入干细胞转归的试剂盒，其特征在于由纳米粒子超顺磁性氧化铁纳米颗粒及近红外量子点硫化银标记脐带间充质干细胞组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周白，戴建武，胡娅莉，李新安，曹昀，
申请(专利权)人：南京大学医学院附属鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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