本发明专利技术公开了一种制备重组间充质干细胞的方法及其得到的重组间充质干细胞。本发明专利技术的方法通过降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量，得到重组间充质干细胞C3-shM细胞中Mysm1基因的表达量降低，细胞增殖迅速，分化能力增强，PGE2分泌能力增强，对于CD3+T细胞增殖抑制能力增强。本发明专利技术制备方法操作简单、方便实用，建立了快速获得大量间充质干细胞的方法，有望解决临床MSC量不够的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备重组间充质干细胞的方法及其得到的重组间充质干细胞。
技术介绍
间充质干细胞（Mesenchymal Stem cell, MSC)是最早从骨髓中分离的一种非造血 干细胞。MSC可分化为成骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞、神经元、肌肉细胞和肠上皮细胞 等。MSC的多向分化特性使其成为理想的种子细胞用于衰老、病变引起的组织损伤修复及抑 制免疫相关疾病。虽然MSC可从多种组织中分离获得，但在临床应用中存在的普遍问题是 MSC纯度不够、数量不够且自我更新能力差等。 Mysml 是 MYb_like, SWIRM and MPN domain-containing protein-1 的缩写，又称 为2A-DUB，或者KIAA1915/MYSM1，是组蛋白H2A去泛素化酶之一。Mysml可以特异性的调节 组蛋白H2A的单泛素化，从而改变组蛋白修饰，进而影响基因的转录。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何快速获得大量的间充质干细胞。 为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种重组间充质干细胞的制备方法。 本专利技术所提供的重组间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：降低受体间充质 干细胞中Mysml基因的表达量，得到重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的 间充质干细胞；所述Mysml为组蛋白H2A去泛素化酶。 本专利技术的重组间充质干细胞与所述受体间充质干细胞相比，所述Mysml基因的表 达量降低；所述Mysml基因的表达量可以为Mysml基因的mRNA水平。 上述方法中，所述Mysml是氨基酸序列为SEQ ID No. 1所示的蛋白质。SEQ ID No. 1 由819个氨基酸组成。 上述方法中，所述Mysml基因为编码SEQ ID No. 1所示蛋白质的基因，其cDNA序 列为SEQ ID No. 2所示。 上述方法中，所述降低受体间充质干细胞中Mysml基因的表达量包括向受体间充 质干细胞中导入抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysml基因表达的物质。 上述方法中，所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysml基因表达的物质为下 述1)-10)中任一种生物材料： 1) shRNA，是形成茎环结构的短发夹RNA ; 2)表达1)所述的shRNA的表达载体； 3)表达1)所述的shRNA的重组微生物细胞； 4)表达1)所述的shRNA的重组动物细胞； 5)表达1)所述的shRNA的重组植物细胞； 6) 1)所述 shRNA 产生的 siRNA ; 7)表达6)所述siRNA的表达载体； 8)表达6)所述siRNA的重组微生物细胞； 9)表达6)所述siRNA的重组动物细胞； 10)表达6)所述siRNA的重组植物细胞。 上述方法中，所述生物材料中，1)所述的shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No. 3。 上述方法中，所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysml基因表达的物质可为 表达所述shRNA的重组慢病毒LV-shmMysml〇 上述方法中，所述重组慢病毒LV-shmMysml与所述受体间充质干细胞共培养，抑 制所述受体间充质干细胞中所述Mysml基因的表达。 上述方法中，所述重组慢病毒LV-shmMysml按照如下方法制备：将表达SEQ ID No. 3所示的shRNA的重组质粒、质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2. G共转染哺 乳动物细胞，培养细胞后得到所述重组慢病毒。 上述方法中，所述表达SEQ ID No. 3所示的shRNA的重组质粒具体可为质粒 pLKO. 1-shmMysmlo 上述方法中，所述哺乳动物细胞具体可为293T/17细胞 上述方法中，所述重组慢病毒的感染剂量Μ0Ι可为（5-40)，具体可为5。 上文中，所述离体的间充质干细胞可为哺乳动物的离体的间充质干细胞，具体可 为小鼠的离体的间充质干细胞（胚胎间充质干细胞）。 本专利技术所提供的上述方法制备得到的重组间充质干细胞也属于本专利技术保护的范 围。 上述重组间充质干细胞具有下述1)-6)中至少一种特性： 1)所述重组间充质干细胞的增殖能力高于所述受体间充质干细胞； 2)所述重组间充质干细胞的分化能力高于所述受体间充质干细胞； 3)所述重组间充质干细胞的成骨标志基因 RUNX2的表达能力高于所述受体间充 质干细胞； 4)所述重组间充质干细胞的成脂标志基因 PPARy的表达能力高于所述受体间充 质干细胞； 5)所述重组间充质干细胞的前列腺素 E2分泌能力高于所述受体间充质干细胞； 6)所述重组间充质干细胞的免疫抑制能力高于所述受体间充质干细胞。 上文中，所述免疫抑制能力可为抑制T细胞增殖的能力，具体可为抑制CD3+T细胞 增殖的能力。 实验证明，采用本专利技术的方法制备的重组间充质干细胞C3_shM细胞干扰了 Mysml 基因的表达，增殖迅速，分化能力增强。以C3H/10T1/2细胞中Mysml基因的mRNA相对于 β-actin基因的mRNA表达量为1，C3-G细胞中Mysml基因的mRNA相对于β-actin基因 的mRNA表达量为0. 96，C3_shM细胞中Mysml基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA 表达量为0. 56。C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞的增殖能力相当，C3-shM细胞的增殖能力明 显强于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，C3-shM细胞的BrdU阳性细胞比例为24. 1%，C3-G 细胞的BrdU阳性细胞比例为15. 3%。C3-shM细胞中成骨相关基因 RUNX2的表达量和成 脂相关基因 PPARy的表达量均明显高于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，以C3-G细胞中成 骨相关基因 RUNX2相对β -actin的表达量为1，C3-shM细胞中成骨相关基因 RUNX2相对 β -actin的表达量为23 ;以C3-G细胞中成脂相关基因 PPAR γ相对β -actin的表达量为 l，C3-shM细胞中成脂相关基因 PPARy相对β-actin的表达量为15。在TNF-α和IFN-γ 的刺激下，诱导培养的C3-shM细胞中PGE2基因表达水平显著升高，是诱导培养的C3-G细 胞中PGE2基因表达水平的5倍；在非诱导培养和诱导培养条件下，C3-shM细胞分泌PEG2 的水平均明显高于C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞，C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞分泌PEG2 的水平相当。C3-shM细胞对CD3+T细胞的增殖抑制能力明显强于C3H/10T1/2细胞和C3-G 细胞，C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞对CD3+T细胞的增殖抑制能力相当。当C3-shM细胞与 ⑶3+T细胞的数量比为1:10时，⑶3+T细胞的增殖率只有33. 2%，强于相同条件下C3-G细 胞（57. 7% )对⑶3+T细胞增殖抑制能力；单纯⑶3+T细胞的增殖率为85. 7%。本专利技术制 备方法操作简单、方便实用，建立了快速获得大量间充质干细胞的方法，有望解决临床MSC 量不够的问题。【附图说明】 图1为重组间充质干细胞的免疫表型鉴定结果图。C3-G细胞和C3_shM细胞免疫 表型鉴定图中的横坐标和纵坐标与C3H/10T1/2细胞免疫表型鉴定图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量，得到重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述Mysm1为组蛋白H2A去泛素化酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江小霞，王常勇，李萍，杨燕美，董晓惠，王妍，周瑾，崔殿超，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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