人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法及其应用技术

一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤后，收集滤液；再将滤液离心，收集离心上清液，按离心上清液体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液，并充分混匀后第二次离心，最后所得沉淀即为exosome。本发明专利技术的方法，取材方便，易于富集扩增培养，将P2～P3代胎盘间充质干细胞培养基上清再利用获取exosome，不涉及医学伦理问题。exosome分离过程中采用膜过滤、离心和加入聚乙二醇溶液等手段有效增加exosome富集，耗时短，成本低。

Human placenta derived mesenchymal stem cell source, method for separating extra body and application thereof

A human placenta derived mesenchymal stem cells source separation methods exosomes, P2 ~ P3 of placenta derived mesenchymal stem cells confluence rate was 85% ~ 90%, the collection medium, obtaining cell culture supernatant and membrane filtration, the filtrate was collected; centrifuging the filtrate, collecting centrifugal supernatant, centrifugation and supernatant Volume 1: 1 ratio of adding 10w/v% ~ 12w/v% peg supernatant solution, and mixing second times after centrifugation, finally the precipitation is exosome. The method of the invention has the advantages of convenient material extraction, easy enrichment and amplification and culture, and the use of the supernatant of the placenta mesenchymal stem cell culture medium from P2 to P3 to obtain the exosome, and does not involve medical ethical problems. In the process of exosome separation, membrane filtration, centrifugation and polyethylene glycol solution are used to increase exosome concentration, which is short of time and low in cost.

【技术实现步骤摘要】
人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法及其应用
本专利技术涉及一种获取参与细胞生物活动的膜泡的方法，尤其涉及一种由人胎盘间充质干细胞分离并获取外泌体(exosome)的方法，及其在细胞修复中的应用。
技术介绍
外泌体(exosome)是由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的exosome，而这些特定细胞源的exosome与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的exosome上含有MHCII类分子。因此，不同细胞源的exosome所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的exosome能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性exosome则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故exosome有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。人胎盘属于医疗废弃物，胎盘间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)分离来源于胎盘绒毛膜，胎盘绒毛膜富含间充质干细胞，是一个可能优于骨髓和其它组织的种子细胞源泉，目前报道的MSCs主要来源于骨髓，但骨髓中的含量很低，仅占骨髓中单个核细胞的1/106～1/105，使骨髓来源的MSCs受到了限制。另外的牙髓、脂肪和脐血源的间充质干细胞也有报道，但它们的MSCs含量稀少，分离困难，不适合规模化操作。胎盘间充质干细胞来源于人胎盘，取材方便，可在较短的时间内可获得更多的细胞数量，能较好的满足exosome的提取、富集和制备。目前研究发现，胎盘间充质干细胞来源的exosome携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，exosome中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的exosome携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的exosome脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHCI/II分子以及CCR5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。目前进行exosome提取的方式和途径也多种多样，如：骨髓中提取、外周血中提取等，这些exosome获取的途径均需要有创伤性的细胞或组织来源。exosome提取方法主要采用超速离心法或昂贵的试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的exosome质量不均一、不能保证exosome所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的exosome获取，并且成本昂贵。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，大幅度提高exosome的获取量，并使得成本得以显著下降。本专利技术的另一个目的在于提供一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，操作简便，耗时短，并使得成本得以显著下降。本专利技术的再一个目的在于提供一种分离自人胎盘间充质干细胞源的外泌体在细胞和组织修复中的应用。本专利技术的又一个目的在于提供一种分离自人胎盘间充质干细胞源的外泌体在对心肌细胞增殖和损伤修复中的应用。本专利技术提供的一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其包括如下步骤：P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜(如：0.22μm)过滤后，收集滤液；再将滤液离心(如：4℃，10,000g，30min-45min)，收集离心上清液，按离心上清液体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的溶液，并充分混匀后第二次离心(如：4℃，100,000g～120,000g，75min～85min)，最后所得沉淀即为exosome。本专利技术所用的培养基如：CN103805562B。本专利技术提供的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，在获取P2～P3胎盘间充质干细胞还包括：步骤1：去除胎盘脐带侧的羊膜，分离得到绒毛膜；步骤2：再去除绒毛膜表面黏附的结缔组织；步骤3：将绒毛膜剪碎成小块(如；体积约为1mm3)，加入等体积II型胶原酶消化；步骤4：离心去除组织块、胶原酶分离得到胎盘间充质干细胞，接种(如：于T25cm2型细胞培养瓶中)，并进行原代培养和传代培养。步骤5：取P2～P3细胞进行流式表面抗原鉴定；步骤6：取P2～P3细胞接种并进行培养细胞；步骤7：当P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时收集。本专利技术提供的获取P2～P3胎盘间充质干细胞的方法，II型胶原酶的终浓度0.1w/v％～0.2w/v％，消化时间为90分钟～100分钟，消化温度为37℃±1℃，还配合采用速率为200rpm～300rpm的振荡。本专利技术提供的获取P2～P3胎盘间充质干细胞的方法，间充质干细胞培养过程中每隔3天更换一次培养基，直至细胞愈合度达到85-90％进行培养基收集。本专利技术提供的获取P2～P3胎盘间充质干细胞的方法，流式表面抗原鉴定使用的抗体为下列鼠抗人单克隆抗体：CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP作为同型对照。本专利技术提供的另一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其包括如下步骤：步骤8：提取P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时收集的细胞培养基上清液，进行膜过滤，并收集滤液；步骤9：离心步骤8所得的滤液，弃沉淀，收集离心上清液；步骤10：向离心上清液中按体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液后，第二次离心，所得沉淀即为exosome。本专利技术提供的上述人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，对于第二次离心所得的沉淀，还可使用缓冲液(如：PBS)进行重悬后，实施第三次离心(如：4℃，100,000g～120,000g，75min～85min)，而获取沉淀物，以进一步纯化exosome。根据本专利技术提供的各种方法获取的外泌体，具有细胞和组织修复的作用，可制成药物或医疗器械用于细胞和组织修复，尤其是在心肌细胞增殖和损伤修复中的应用。本专利技术技术方案实现的有益效果：本专利技术提供的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，从组织或细胞来源方面，本专利技术技术方案充分利用医疗废弃物——人胎盘作为exosome获取的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于包括如下步骤：P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤后，收集滤液；再将滤液离心，收集离心上清液，按离心上清液体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液，并充分混匀后第二次离心，最后所得沉淀即为exosome。

【技术特征摘要】
1.一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于包括如下步骤：P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤后，收集滤液；再将滤液离心，收集离心上清液，按离心上清液体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液，并充分混匀后第二次离心，最后所得沉淀即为exosome。2.根据权利要求1所述的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于所述的膜为0.22μm滤膜。3.根据权利要求1所述的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于所述的滤液离心温度为4℃，重力加速度10,000g，时间为30min-45min。4.根据权利要求1所述的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于所述的第二次离心温度为4℃，重力加速度100,000g～120,000g，时间为75min～85min。5.根据权利要求1所述的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于向所述的第二次离心所得沉淀中加入缓冲液进行重悬后，实施第三次离心，而获取沉淀物。6.根据权利要求5所述的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于向所述的第三次离心温度为4℃，重力加速度100,000g～120,000g，时间为75min～85min。7.根据权利要求1所述的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其特征在于在获取P2～P3...

【专利技术属性】
技术研发人员：章毅，陈亮，伍婷，
申请(专利权)人：章毅，中国干细胞集团上海生物科技有限公司，重庆市干细胞技术有限公司，陕西省干细胞技术有限公司，苏州市干细胞技术有限公司，上海市干细胞技术有限公司，三亚市干细胞技术有限公司，中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31