本发明专利技术提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，本发明专利技术制备方法在胎盘采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者，最终选择男婴作为采集目标，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的中间品进行一系列质量检测包括母源检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低，细胞生物学功能完整。本发明专利技术获得的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞成分单一，又拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现间充质干细胞的临床标准产品，再者壁蜕膜从起源上来自于母亲，更加适合母亲自体使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属细胞生物学领域，具体涉及一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的 制备方法。
技术介绍
干细胞（StemCells，SC)是一类具有自我复制能力（self-renewing)的多潜能细 胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组 织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂 成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括 胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。 銳膜间充质干细胞（Decidua-derivedmesenchymalstemcells，DMSCs)除了具 有间充质干细胞一般表型及分化潜能外，还具有低免疫原性等独特性质，是一种多能基质 细胞。蜕膜间充质干细胞不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境，而且通过表达免疫调控 因子与多种免疫细胞相互作用，如T细胞、NK细胞及DC等，发挥其在胚胎植入、免疫耐受 建立及正常妊娠维持中的重要作用。目前蜕膜间充质干细胞已经应用于再生治疗，具有较 高的临床应用价值。 蜕膜间充质干细胞（DMSC)与人脐带间质干细胞UCMSC相比，都来源于废弃组织， 取材方便、不对人体造成伤害、不涉及伦理道德问题，且免疫原性低、具有免疫抑制性，可以 抑制其他细胞引起的免疫反应，减缓移植物抗宿主病，分泌多种细胞因子，抑制炎症反应、 细胞凋亡，具有造血支持作用，表达间充干细胞标记。但DMSC具有更强的跨系分化能力， 能分化成外、中、内胚层细胞，表达部分胚胎干细胞标记（SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、C0T4、 REX-UTRA-1-61)，有人称DMSC为亚全能干细胞，其发育阶段上与胚胎干细胞接近。相对于 骨髓间充质干细胞（BMMSC)，DMSC增殖迅速、更强的长期增殖能力、多系分化能力更佳。并 且，DMSC可以和UCMSC-样进行深低温保存，可用于建立细胞库，而骨髓来源MSC却很难实 现。 胎盘壁脱膜中含有丰富的间充质干细胞，易于体外分离培养，细胞数量更多，体外 可大量扩增，缩短细胞培养的时间，取材方便，且具有多向分化潜能，因而具有更大的临床 应用价值，是细胞移植治疗和组织工程学的良好来源。 壁蜕膜作为母胎组成部分之一，跟其他间充质干细胞一样，符合2006年国际干细 胞协会发表的间充质干细胞的特性。贴壁生长，流式指标合格，具有成骨、成脂、成软骨的能 力。此外壁脱膜细胞还能产生某些免疫抑制因子而使其具有免疫抑制效应，不但为妊娠期 间胚胎植入提供适宜环境，而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用，从而对 胎儿成长发育免疫受排斥起着至关重要的作用。 目前常规培养间充质干细胞多用动物血清，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取 量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织 向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。 但目前公开的各类胎盘间充质干细胞制备方法虽均能获得间充质干细胞，但都不 一定为母源性，也不符合临床应用的标准，本专利技术拟从原料采集开始直至细胞制备完成的 全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的临床标准产品。
技术实现思路
针对现有技术缺陷，本专利技术提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备 方法，本专利技术制备方法在胎盘采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者 作为采集目标，且采集男婴胎盘，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻 保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用， 活率无明显降低。 本专利技术提供，所述制备方法 为： A、壁蜕膜分离：将分离获得的胎盘用生理盐水清洗后，剥离壁蜕膜，并将撕下的壁 蜕膜剪成小块置于离心管中； B、使用胶原酶对离心管中的壁蜕膜进行消化；C、间充质干细胞原代培养：将消化后的壁蜕膜进行过滤，洗涤后得间充质干细胞， 将间充质干细胞在完全培养基中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm2,此后每3天换液一 次，至细胞融合度达80%以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；D、间充质干细胞传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm2;3 天后，细胞密度达80 %以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，按2X107/ml/ 管进行冷冻保存；E、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：液氮取出冷冻细胞，复苏，复苏后洗涤两遍， 统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留 样进行内毒素和细菌检测。 优选地，步骤A中，所述胎盘为经过筛选、采集的健康足月男婴胎盘，分离获得的 胎盘需置于胎盘保存盒中4°C冷藏，并于24小时内进行处理。 优选地，所述筛选的检测项目包括携带病毒、遗传家族史等；所述病毒如乙肝、丙 肝、艾滋、梅毒等。 所述壁蜕膜组织来自母体。 优选地，所述步骤A中，将撕下的壁蜕膜剪成1~4mm3的小块。 优选地，所述步骤B中，使用浓度为2mg/ml的II型胶原酶对壁蜕膜进行消化，消化 温度37°C，消化1小时，恒温振荡。本专利技术采用浓度为2mg/ml的II型胶原酶对壁蜕膜进行 消化，操作过程比较简单方便，且其消耗组织块用时少，缩短了细胞培养时间及培养周期， 且从获取细胞数量上讲也有大量研究数据表明其数量较多。 优选地，所述步骤C中，采用输血器滤网进行过滤，所述在完全培养基中培养的条 件为37°C、5%C02、饱和湿度环境；所述胰蛋白酶的浓度为0. 125%，由0. 25%成品胰酶稀 释1倍制成。本专利技术中用的是浓度为〇. 125%的胰蛋白酶，研究表明在其他条件相同的情况 下，浓度为〇. 125%的胰蛋白酶在细胞贴壁生长的环境下的其消化能力达到最强，细胞也不 会受到相应的影响。 优选地，所述输血器滤网孔径< 17μm，总有效过滤面积为24-34厘米可以滤除 血液和血液成分制品中可能存在的聚集的血小板、白细胞和纤维蛋白；所述完全培养基由 基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例为10%，谷氨酰胺比例 0· 02mmol/ml〇 优选地，所述步骤D中，对收集的细胞统计细胞数和细胞活率，并对细胞上清进行 无菌检测、支原体检测；以及对间充质干细胞进行表面标志、分化检测。 优选地，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包 括用PCR法进行支原体检测。 优选地，所述对间充质干细胞进行表面标志、分化检测具体为：按照间充质干细胞 标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代间充质干细胞进行分化实验检测干细胞分化能 力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红〇染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色 鉴定。 优选地，所述阳性指标如⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105等；所述阴性指标如⑶19、 CD14、CD34、CD45、HLA-DR。 优选地，所述步骤E中，复苏条件为40°C，2min;复苏后用生理盐水300g，洗涤两 次每次l〇min。 优选地，步骤D中，所述冷冻保存所用细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚 砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度10%。 本专利技术制备的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞通过PCR扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：A、壁蜕膜分离：将分离获得的胎盘用生理盐水清洗后，剥离壁蜕膜，并将撕下的壁蜕膜剪成小块；B、使用胶原酶对壁蜕膜进行消化；C、间充质干细胞原代培养：将消化后的壁蜕膜进行过滤，洗涤后得间充质干细胞，将间充质干细胞在完全培养基中培养；细胞密度达约8000‑9000个/cm2，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；D、间充质干细胞传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000‑9000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，进行冷冻保存；E、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：取出冷冻细胞，复苏，复苏后洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏量，
申请(专利权)人：上海百众源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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