一种胎盘绒毛板间充质干细胞及临床化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胎盘绒毛板间充质干细胞，其临床化制备方法包括以下步骤：(1)获取胎盘绒毛板；(2)去除血管和绒毛组织；(3)用无菌生理盐水清洗至没有血色；(4)将绒毛板组织剪成1‑5mm2，用生理盐水清洗；(5)将组织块接种于完全培养基中，于37℃、5％CO2潮湿培养箱中培养；(6)每隔5‑10天更换一次培养基，当细胞融合度为70‑80％时，用TrypLETM Select消化细胞；(7)传化培养；(8)检测；(9)冻存；(10)建库。本发明专利技术以胎盘绒毛板为材料，提取过程中无需分选、浸泡、过滤和梯度离心，在较低代次可得到较多细胞，大大降低了成本消耗、分离时间，提高了间充质干细胞的产率和纯度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及间充质干细胞的制备
，具体涉及一种胎盘绒毛板间充质干细胞及临床化制备方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的诱导条件下可以分化形成多种组织来源的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成神经细胞等。间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，而且还具有自我更新、归巢、免疫调节、造血支持、分泌多种细胞因子、促进干细胞移植等多种生物学特性，是参与组织损伤修复和组织再生的重要细胞组成部分。目前，可以从多种成体组织(如骨髓)或围产期组织(如胎盘)提取间充质干细胞。骨髓组织因其间充质干细胞含量少(约为骨髓单个核细胞的0.0001～0.001％)，给供者造成巨大伤害等因素使其在临床应用中受到限制。胎盘是胎儿发育期的一个附属组织，在胎儿生产后被当作医疗垃圾废弃掉，不仅对环境造成污染而且对医学资源也造成重大浪费。胎盘由绒毛板、绒毛层、蜕膜构成，绒毛板外层由羊膜覆盖、内层由滋养层细胞覆盖，而脐带末梢血管则穿行其中，因此绒毛板在组织结构上保持相对独立性，是一种较易分离的胎盘组织。研究表明胎盘绒毛板中含有大量的间充质干细胞，所以从胎盘绒毛板分离提取间充质干细胞将会为间充质干细胞的实验研究和临床应用开辟一条崭新的道路。从实体组织提取间充质干细胞的方法主要采用酶消化法。酶消化法是一种快速从实体组织提取间充质干细胞的方法，但这种方法获得的细胞包含多种细胞成分，往往采取多种方法加以纯化，如密度梯度离心法、流式细胞仪分选、磁珠分选、血细胞裂解液去除血细胞等纯化方法。不仅酶的种类和酶溶液的配方影响酶消化法的作用效果，而且酶的使用还会引入多种外源干扰因素。因此，酶消化法不仅增加了生产成本，而且使工艺变得复杂，从而影响工艺的稳定性。现有的胎盘间充质干细胞制备工艺存在诸多不足，如工艺复杂、生产成本高、较多的外源干扰因素等。如中国专利CN101270349A公开了胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，该方法采用Ⅳ型胶原酶消化母体侧蜕膜胎盘组织，接着扩增获得分离得到的细胞，然后用正负磁珠进行分选纯化得到胎盘间充质干细胞。中国专利CN102586184A公开了建立胎盘间充质干细库的方法，该方法采用组织消化酶液(含dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶)消化胎盘小叶组织，通过克隆挑取扩增获得胎盘间充质干细胞，上述方法在工艺简化和生产成本降低方面还有待进一步提高。
技术实现思路
针对于现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种胎盘绒毛板间充质干细胞及临床化制备方法，本专利技术以胎盘绒毛板为材料提取间充质干细胞，提取过程中无需分选，无需浸泡，无需过滤和梯度离心，在较低代次即可得到较多细胞，大大降低了成本消耗，降低了分离时间，提高了间充质干细胞的产率和纯度。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种胎盘绒毛板间充质干细胞的临床化制备方法，包括以下步骤：(1)采集母血，并进行传染病检测，然后取出胎盘，弃去覆盖在外侧的羊膜，用无菌手术剪取胎盘绒毛板；(2)使用无菌组织镊剔除附着在胎盘绒毛板上的血管和绒毛组织；(3)用无菌生理盐水清洗步骤(2)所得的胎盘绒毛板至没有血色；(4)使用无菌手术剪将清洗后的绒毛板剪成1-5mm2的组织块，然后用无菌生理盐水清洗2-5次；(5)将步骤(4)中的组织块接种于完全培养基中，然后置于37℃、5％CO2潮湿培养箱中培养；其中完全培养基成分为：无血清培养基(Cellgenix)、30ng/mL bFGF(Cellgenix)、体积浓度为2％的GlutaMAX(invitrogen)；(6)每隔5-10天更换一次培养基，当细胞融合度达到70-80％时，用TrypLETMSelect消化细胞；(7)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，按1×104-2×104个细胞/cm2的密度(此处密度为细胞个数与培养瓶底表面积的比计算得来)接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，得胎盘绒毛板间充质干细胞；(8)针对步骤(7)所得的胎盘绒毛板间充质干细胞，检测以下项目中的至少一项：细胞活性、无菌检测、细胞表面标志物检测、核性检测、HLA-ABC/DR配型；(9)冻存：将传代培养后的胎盘绒毛板间充质干细胞按2×106-8×106个细胞/mL密度冻存于1mL冻存液中，冻存细胞经程序降温至-80℃后转入液氮罐中长期保存；(10)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(9)的冻存细胞进行关联。进一步地，步骤(1)中对胎盘的处理需在采集后72h内进行。进一步地，步骤(5)中组织块与完全培养基的w/v为(0.5-2.0:10-15)g/mL。进一步地，步骤(7)传代培养过程中细胞密度为1×104个细胞/cm2。进一步地，步骤(9)中所述冻存液由以下组分组成且各组分的质量分数为：80％无血清培养基(Cellgenix)、13％人血白蛋白(Sigma)、7％二甲基砜(Origen)。进一步地，步骤(9)中冻存时细胞密度为2×106个细胞/mL。根据上述任一项方法制备得的胎盘绒毛板间充质干细胞。本专利技术提供的一种胎盘绒毛板间充质干细胞及临床化制备方法，具有以下几种有益效果：(1)本专利技术使用的提取方法，步骤简单，分离得到胎盘绒毛板组织块后只需直接贴壁培养即可得到纯度高的间充质干细胞，不仅简化了工艺流程，而且避免引入较多外源干扰因素，使得工艺稳定性较易控制。(2)本专利技术以胎盘绒毛板为材料提取间充质干细胞，提高了从胎盘中提取间充质干细胞的产率。(3)提取过程中无需分选，无需浸泡，大大降低了成本消耗。(4)本专利技术针对提取胎盘间充质干细胞耗时较长的问题，提供了一种无需过滤，无需梯度离心的组织贴壁法，大大降低了分离时间，减少了此过程中的细胞消耗。(5)本专利技术在较低代次即可得到较多细胞，避免多次传代造成的间充质干细胞干性降低，提高了间充质干细胞的纯度。附图说明图1为组织贴壁法培养细胞情况的SEM图；其中图1-1为贴壁培养7天后的细胞情况；图1-2为贴壁培养14天后的细胞情况。图2为胎盘绒毛板间充质干细胞传代培养情况的SEM图；其中图2-1为P1代胎盘绒毛板间充质干细胞；图2-2为P2代胎盘绒毛板间充质干细胞。图3为胎盘绒毛板间充质干细胞多向诱导分化图；其中图3-1为对照组；图3-2为成脂诱导分化；图3-3为成软骨诱导分化；图3-4为成骨诱导分化。图4为胎盘绒毛板间充质干细胞表面标志物检测结果图。图5为胎盘绒毛板间充质干细胞核型分析图；其中图5-1为P3代细胞核型分析；图5-2为P15代细胞核型分析。图6为胎盘绒毛板间充质干细胞干性标志物检测结果图。图7为胎盘绒毛板间充质干细胞分泌的细胞因子检测结果图。图8为P1-P3代细胞生长特性测定结果图。图9为P1-P10代细胞倍增时间的测定结果图。具体实施方式实施例1胎盘绒毛板间充质干细胞的分离(1)与供者签订知情同意书，采集足月胎盘，72h内对其进行如下处理：用无菌止血钳剥离覆盖绒毛板外侧的羊膜；用无菌手术剪剪取足量的胎盘绒毛板组织；(2)使用无菌组织镊剔除附着在胎盘绒毛板上的血管和绒毛组织；(3)用无菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胎盘绒毛板间充质干细胞的临床化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集母血，并进行传染病检测，然后取出胎盘，弃去覆盖在外侧的羊膜，剪取胎盘绒毛板；(2)剔除附着在胎盘绒毛板上的血管和绒毛组织；(3)用无菌生理盐水清洗步骤(2)所得的胎盘绒毛板至无血色；(4)将清洗后的绒毛板剪成1‑5mm2的组织块，然后用无菌生理盐水清洗2‑5次；(5)将步骤(4)中的组织块接种于完全培养基中，置于37℃、5％CO2潮湿培养箱中培养；其中完全培养基成分为：无血清培养基、30ng/mL bFGF、体积浓度为2％的GlutaMAX；(6)每隔5‑10天更换一次培养基，当细胞融合度达到70‑80％时，用TrypLETM Select消化细胞；(7)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，按1×104‑2×104个细胞/cm2的密度接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，得胎盘绒毛板间充质干细胞；(8)针对步骤(7)所得的胎盘绒毛板间充质干细胞，检测以下项目中的至少一项：细胞活性、无菌检测、细胞表面标志物检测、核性检测、HLA‑ABC/DR配型；(9)冻存：将传代培养所得的胎盘绒毛板间充质干细胞按2×106‑8×106个细胞/mL密度冻存于1mL冻存液中，冻存细胞经程序降温至‑80℃后转入液氮罐中长期保存；(10)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(9)的冻存细胞进行关联。...

【技术特征摘要】
1.一种胎盘绒毛板间充质干细胞的临床化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集母血，并进行传染病检测，然后取出胎盘，弃去覆盖在外侧的羊膜，剪取胎盘绒毛板；(2)剔除附着在胎盘绒毛板上的血管和绒毛组织；(3)用无菌生理盐水清洗步骤(2)所得的胎盘绒毛板至无血色；(4)将清洗后的绒毛板剪成1-5mm2的组织块，然后用无菌生理盐水清洗2-5次；(5)将步骤(4)中的组织块接种于完全培养基中，置于37℃、5％CO2潮湿培养箱中培养；其中完全培养基成分为：无血清培养基、30ng/mL bFGF、体积浓度为2％的GlutaMAX；(6)每隔5-10天更换一次培养基，当细胞融合度达到70-80％时，用TrypLETM Select消化细胞；(7)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，按1×104-2×104个细胞/cm2的密度接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，得胎盘绒毛板间充质干细胞；(8)针对步骤(7)所得的胎盘绒毛板间充质干细胞，检测以下项目中的至少一项：细胞活性、无菌检测、细胞表面标志物检测、核性检测、HLA-ABC/DR配型；(9)冻存：将传代培养所得...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，
申请(专利权)人：四川华皓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51