区别间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种在源自胎盘相关组织的细胞的初代培养中区别间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的方法。本发明专利技术还提供一种在源自胎盘相关组织的细胞的初代培养中提高MSC群体的纯度的方法。本发明专利技术进一步提供一种分离在发炎环境中较具反应性的MSC群体的方法。所述方法各包含一通过一EphA2标志分选细胞的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种在源自胎盘相关组织的细胞的初代培养中区别间充质干细胞(MSC)的方法。本专利技术还涉及一种在源自胎盘相关组织的细胞的初代培养中提高MSC群体的纯度的方法。另一方面，本专利技术涉及一种分离在发炎环境中较具反应性的MSC群体的方法。
技术介绍
间充质干细胞或基质细胞(MSC)是属于胚胎中胚层来源的多能性细胞，其具有类纤维母细胞的形态。所述细胞视刺激及培养条件可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经系细胞及肌细胞与其它细胞类型。尽管hMSC的可塑性及其在组织修复与再生上的角色已广泛地被研究，近来得到最多的关注者是其免疫调控性质[50-51]。人类间充质干细胞已自各种组织分离出。最常用的MSC来源为骨髓(bonemarrow,BM)。然而，其分离程序为极具侵入性的。为避免侵入性的分离程序，诸如人类脐带及胎盘的组织由于通常在生产后被丢弃而被视为良好的候选物。先前研究已证实hMSC可自脐带或胎盘有效率的分离[49]。MSC为包含在间充质组织中的更复杂的基质细胞组成的子群体。由于间充质干细胞的异质性及对其具特异性的已知生物标志的缺乏，定义MSC表型及特征是一项具有挑战性的任务[52-54]。负责MSC功能的分子组份(特别是在细胞膜上者)大多数仍属未知。此外，特异性细胞表面标志的缺乏使得细胞培养处于可能为其它细胞类型污染的风险中，特别是诸如纤维母细胞的成熟基质细胞，其相对地大量存在于间充质组织中[52-54]。在自胎盘源组织分离MSC的过程中，非MSC(包括纤维母细胞、胎盘源上皮细胞及胎盘源网状细胞)常常在体外培养中与MSC共存。纤维母细胞尤其是污染的主要来源。纤维母细胞被视为成熟间充质细胞，尤其大量存在于结缔组织中。因此，该细胞为许多细胞培养系统中最常存在的污染细胞表型。不仅成功地自培养物去除纤维母细胞的技术困难，在相同培养物中区别MSC与纤维母细胞也尤为复杂。纤维母细胞及MSC具有极相似的形态外观；二者均可良好地增生并具有许多相同的细胞表面标志[55,56]。国际细胞治疗研讨会(InternationalSocietyofCellularTherapy,ISCT)目前定义MSC为表达CD73、CD90及CD105的具塑料贴附性的多能性类纤维母细胞的细胞，且不表达造血标志CD14、CD34及CD45。然而，纤维母细胞也具有所述性质及标志。因此，目前由ISCT建议的定义无法区别MSC与一般纤维母细胞。至今，区别MSC与纤维母细胞的最佳方式是基于此两种细胞的功能特性的分析；MSC保留多能性干细胞性及免疫调控能力，而纤维母细胞在此二功能特性中都显得较为受限。自Friedenstein在辨别MSC上的开创性成果以来[48]，在寻求稳定且明确地区别离体培养扩增的MSC与纤维母细胞方面，培养衍生方法学、形态学及基因表达特征并无明显的差异[57-60]。目前，对于分离MSC与纤维母细胞不存在公认的标准或单一细胞表面标志。由于纤维母细胞为常见于源自胎盘的MSC培养物中的污染细胞群体的事实，作为生物标志以区别MSC与纤维母细胞的新颖表面蛋白对于确保胎盘源MSC的初代培养的均一性极为重要。人类促红血球生成素产生肝细胞(Eph)受体为组成受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinases,RTK)跨膜蛋白质的最大家族。Eph受体最早发现的功能是其在轴突导向的复杂且精密的机制中的角色[4]。目前已知Eph受体可调控胚胎发育期间的细胞定位及组织模式形成以及诸如癌症及血管并发症的病理症状中所涉及的广泛范围的细胞-细胞间通讯事件[1-5]。此外，所述受体为特化细胞功能的重要调控子，参与在突触可塑性、胰岛素分泌、骨重塑、上皮衡定以及发炎与免疫反应中[1,2,6]。其表达于多种细胞类型，诸如：神经元、血管细胞、上皮细胞、炎性细胞、免疫细胞及包括癌症干细胞的肿瘤细胞[7-10]。EphA2基因属于蛋白质－酪氨酸激酶家族的Eph受体亚族。先前研究已指出EphA2在介导发育事件(尤其在神经系统中)的功能[4]。在发育期间，EphA2作用于模式形成的特定方面与其后的数种胎儿组织的发育，包括：血管新生、神经管发育、轴中胚层生成、早期后脑发育、神经分化、细胞迁移调控、经由蚀骨细胞生成及成骨细胞生成调控的骨重塑及在乳腺发育期间乳腺上皮细胞增生及分枝形态形成[11]。尤其，EphA2在神经系统胚胎发育中的角色[12]，包括神经元送出轴突以到达正确目标的过程，已被明确定义。Eph受体在干细胞生物学中于胚胎发育期间与成人干细胞栖位(niche)中的角色仅于最近才被指出。Eph受体在大多数成人干细胞栖位中表达。干细胞位于特化的微环境－栖位中，其定义为细胞及微环境决定因素的组合，其在特化组织位置内精细安排干细胞群体(pool)的自我更新及分化。Eph受体及ephrin配体在胚胎形成及组织衡定期间的表达与其在发育期间的干细胞调控及在成人组织衡定中所涉入者一致[13,15]。Eph/ephrin系统在干细胞静止、自我更新与分化之间的平衡中进行空间－时间调控的功能已被提出[14]。然而，Eph在干细胞栖位维持中的机制及其在干细胞调控中的角色尚未完全被了解。EphA2大量表达于胚胎干细胞[16]。然而，大多数EphA2在干细胞中的功能研究专注于神经系统上。EphA2在CNS(包括神经系及胶系前驱细胞)中大量表达[12,15]。最近的研究证据显示ephrin-A1可促进EphA2-阳性心脏干细胞的活动性，进而增强心肌梗塞后的再生及心脏功能[17]。除这些发现外，干细胞科学中EphA2的表现档案及功能尚未完全确定。Eph受体及ephrin配体可调控干细胞/先驱细胞的自我更新与肿瘤的演化[14]。未转化干细胞/先驱细胞与癌细胞之间的高相似度也是公认的。近年来，已描述各种癌症藏有“癌症干细胞”区(在癌细胞群体组成中高达25％)的概念[14]。所述细胞被定义为肿瘤增殖细胞(tumor-propagatingcells,TPC)，因其可诱发动物宿主中的肿瘤、自我更新并使扩增的肿瘤细胞体中生成进一部分化的细胞[14]。最近，Eph/ephrin信号被连结至癌细胞去分化与类干细胞性质的调控[9,18,19]。然而，应注意癌症干细胞实际上并非如相关
中通常所指的(多能性)“干细胞”。Ephs的过度表达连带特异ephrin配体的调降已在数种癌症中被报告，并与肿瘤侵略性及较高的级数(grade)相连结[19-22]。EphA2的表达在乳癌、卵巢癌与肺癌以及神经胶质瘤与黑色素瘤中升高，且高量的EphA2与低病患存活率相关[20,23-29]。然而，Eph受体在癌细胞中的角色及其表达是绝对情境相依的。已在某些肿瘤(包括乳癌、大肠直肠癌及急性淋巴性白血病)中观察到相反的表达模式，其中经由表观遗传基因静默或突变造成的低Eph受体表达与不佳预后相关[30]。在人类肾上腺皮质癌、腺瘤与健康肾上腺皮质组织的阵列转录剖析研究中，EphA2在人类肾上腺皮质肿瘤组织中的表达与健康肾上腺皮质组织相比较是调降的[31]。因此，尽管某些Ephs及ephrins的表达模式在许多肿瘤形成病例中可作为预后标志，相反现象也在大量研究报告中被观察到。Eph/ephrins的表达是极度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在源自胎盘相关组织的细胞的初代培养中区别间充质干细胞(MSC)的方法，其包含通过一EphA2标志分离细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在源自胎盘相关组织的细胞的初代培养中区别间充质干细胞(MSC)的方法，其包含通过一EphA2标志分离细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其用于区别MSC与选自纤维母细胞、胎盘源上皮细胞、胎盘源网状细胞及其组合的细胞群。3.根据权利要求1所述的方法，其用于区别MSC与纤维母细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中该胎盘相关组织选自羊膜、绒毛膜盘、绒毛膜及脐带。5.根据权利要求1所述的方法，其中该分离步骤经由一基于抗体或一基于核苷酸的分离方法进行。6.根据权利要求1所述的方法，其中该源自胎盘相关组织的细胞培养于一用于MSC的培养基。7.根据权利要求5所述的方法，其中该基于抗体的分离方法是一基于抗体的磁性细胞分选或一基于抗体的流动式细胞测量术。8.根据权利要求5所述的方法，其中该基于核苷酸的分离方法是一基于核苷酸的流动式细胞测量术。9.一种在源自胎盘相关组织的细胞的初代培养中提高MSC群体纯度的方法，其包含通过一EphA2标志分离细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中该胎盘相关组织选自羊膜、绒毛膜盘、绒毛膜及脐带。11.根据权利要求9所述的方法，其中该分离步骤经由一基于抗体或一基于核...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣昶有，刘威廷，沈似佩，林昀，李原聪，章家绮，
申请(专利权)人：宣捷生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71