人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，为解决现有技术细胞因子产量低、活性差问题。是依次进行脐带间充质干细胞的分离、传代和收集培养上清液，培养上清液过滤浓缩，加入冻干赋形剂和50℃的去离子水，调节蛋白浓度，混匀，分装后于压强50‑100Pa，温度‑30℃‑‑35℃的冻干条件下冻干，即获得人间充质干细胞冻干粉。收集的培养上清液先冷冻保存，培养上清液过滤浓缩是将收集的培养上清液于室温解冻，0.45um滤膜过滤除掉细胞，3KD的过滤膜超滤浓缩将上清液浓缩至原体积的1/10，0.22um滤膜过滤除菌，得人脐带间充质干细胞冻干粉原液再制人脐带间充质干细胞冻干粉。制备的冻干粉能够有效的保存人间充质干细胞分泌的多种具有生物活性的细胞因子，得到的细胞因子产量高、活性好，易保存和运输。

Preparation method of human umbilical cord mesenchymal stem cell factor freeze-dried powder

The invention relates to a preparation method of human umbilical cord mesenchymal stem cell factor freeze-dried powder. Is followed by umbilical cord mesenchymal stem cells were collected and separated, the culture supernatant, the supernatant is filtered and concentrated, adding freeze-dried excipient and deionized water of 50 DEG C, regulating the protein concentration, mixing, packing pressure to 50 100Pa, freeze-drying conditions temperature 30 C 35 C under that is, to obtain lyophilized human mesenchymal stem cells. The culture supernatant was collected before cryopreservation, the supernatant is filtered and concentrated supernatant collected from thawing at room temperature, 0.45um membrane filter off cells, 3KD ultrafiltration membrane filtration and the supernatant was concentrated to the original volume of 1/10, 0.22um membrane filtration, human umbilical cord mesenchymal stem cells from human umbilical cord processed freeze-dried powder dope mesenchymal stem cells freeze-dried powder. The freeze-dried powder prepared by the invention can effectively preserve a plurality of biologically active cytokines secreted by human mesenchymal stem cells, and has high yield, good activity, easy storage and transportation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种冻干粉的制备方法，特别是涉及一种人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点。有研究表明在培养的过程中脐带间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如分泌表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)，肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)，肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)等，这些细胞因子都能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用。近年来随着对干细胞研究的不断深入，将干细胞产品应用到美容行业越来越受到人们关注，市面上大多细胞因子产品蛋白等有效成分含量低，含有大量杂质，不合适的溶媒等，造成皮肤不适过敏等。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种细胞因子产量高、活性好的人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法。为实现上述目的，本专利技术人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法依次进行脐带间充质干细胞的分离、传代和收集培养上清液，培养上清液过滤浓缩，加入冻干赋形剂和50℃的去离子水，调节蛋白浓度，混匀，分装后于压强50-100Pa，温度-30℃--35℃的冻干条件下冻干，即获得人间充质干细胞冻干粉。制备的冻干粉能够有效的保存人间充质干细胞分泌的多种具有生物活性的细胞因子，得到的细胞因子产量高、活性好，易保存和运输，具有良好的市场前景。作为优化，脐带间充质干细胞的分离是取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含双抗的生理盐水保存液中，于冰盒内尽快运输；置于培养皿中剪成小段，用含双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并用眼科剪剪碎成组织块；将组织块按照合适的密度接种于培养皿中，放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁2-3h，添加适量的含FBS的DMEM/F12培养液静置于培养箱中培养，定期观察添加培养液；10d左右在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块，胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移到培养瓶中培养后进行传代。作为优化，含双抗的生理盐水保存液为含1％双抗的生理盐水保存液，含双抗的DPBS是含1％双抗的DPBS，用眼科剪剪碎成组织块是用眼科剪将组织块剪碎至1-2mm3，含FBS的DMEM/F12培养液是含10％的FBS的DMEM/F12培养液，培养瓶是T75cm2的培养瓶，转移到培养瓶中后的细胞为P0代，密度为105/cm2。作为优化，所述传代是当培养瓶中细胞生长达到80％融合时，胰蛋白酶消化，1∶4传代培养，P3代开始使用无血清培养基培养，从P3代开始收集培养上清液。作为优化，所述收集培养上清液是3000r/min离心3min取上清，将多次收集的上清液储存于-20℃，储存作为商品超滤浓缩的细胞因子原液或者储存备用制作制人脐带间充质干细胞冻干粉。储存作为商品超滤浓缩的细胞因子原液也就是本专利技术目的还提供了一种超滤浓缩的细胞因子原液，但是，该细胞因子原液需要在流通阶段保存在零下二十度。作为优化，收集的培养上清液先冷冻保存，培养上清液过滤浓缩是将收集的培养上清液于室温解冻，0.45um滤膜过滤除掉细胞，3KD的过滤膜超滤浓缩将上清液浓缩至原体积的1/10，0.22um滤膜过滤除菌，得人脐带间充质干细胞冻干粉原液再制人脐带间充质干细胞冻干粉。作为优化，制人脐带间充质干细胞冻干粉是人脐带间充质干细胞冻干粉原液加入冻干赋形剂20％的甘露醇和50℃的去离子水，调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照1ml/支分装，于压强50-100Pa，温度-30℃--35℃的冻干条件下冻干24-36h，即获得人间充质干细胞冻干粉。即冻干前，加入冻干赋形剂20％甘露醇，冻干条件为压强50-100Pa，温度-30℃--35℃，冻干时间24-36h。作为优化，间充质干细胞冻干粉制作成1ml/瓶，1mg/ml的细胞因子化妆品制剂；也就是本专利技术还提供了一种规格为1ml/瓶，1mg/ml的细胞因子化妆品。人脐带间充质干细胞冻干粉原液先经人脐带间充质干细胞分泌因子的测定合格后，再制人脐带间充质干细胞冻干粉；获得的人间充质干细胞冻干粉进行人脐带间充质干细胞冻干粉的蛋白含量测定和人脐带间充质干细胞冻干粉外观及稳定性检测。作为优化，细胞因子化妆品制剂一支1ml/瓶配一支2ml冻干粉溶媒直接用作化妆品，其中一支2ml冻干粉溶媒由化妆品级的高分子量的透明质酸和甘油1∶1混合而成；人脐带间充质干细胞分泌因子的测定是ELISA试剂盒对过滤浓缩的细胞因子原液中两种细胞因子表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子FGF的含量进行测定；人脐带间充质干细胞冻干粉的蛋白含量测定是用总蛋白定量测试盒BCA法，冻干粉一支溶于一支溶媒中取样，5倍稀释6个测定管，双蒸水空白管和标准管，酶标仪测定各管吸光值，计算总蛋白含量，每支冻干粉的蛋白含量应在1mg±0.05mg；人脐带间充质干细胞冻干粉外观及稳定性检测是所生产的冻干粉为白色无杂质粉末状，用溶媒溶解后为淡黄色至无色略粘稠液体，澄清透明；精密PH试纸检测所溶解的冻干粉，PH值在6.5-7.5之间；冻干粉在室温下保存，1d/7d/14d外观无变化；溶解后4℃保存，1d/7d/14d外观无变化。作为优化，P3代开始使用无血清培养基培养前先进行脐带间充质干细胞的鉴定；脐带间充质干细胞的鉴定是收集P3代细胞，用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原，结果表明细胞能够表达干细胞特征性表面抗原CD73、CD90、CD105等，未能表达表面抗原CD19、CD34、CD45等，证明培养的细胞为人间充质干细胞后，再使用无血清培养基培养。本专利技术所生产的冻干粉成品含有多种对皮肤有益的细胞因子，经过本专利技术纯化的细胞因子原液纯度高，蛋白含量高，效果显著。提供的细胞因子产品能够促进表皮细胞生长、促进伤口愈合、抗氧化、抗皱、延缓衰老、晒后修复、美白等功效，使皮肤处于最佳状态。脐带的采集简单易行，不会对母体和婴儿产生伤害，所生产的冻干粉纯天然无任何添加、性质稳定、动物实验表明无致瘤性、无毒性。取材方便，安全。过去培养间充质干细胞的培养液都作为废物丢弃，现在通过收集冻干等技术生产一种天然化妆品，易获得数量充足。通过冻干技术所生产的冻干粉，能够长期保存并保持因子的活性，易运输使用方便，很大程度上解决了细胞因子的保存和运输问题。很多冻干粉都是将其作为一种添加物加到化妆品中，本专利技术提供一种透明质酸和甘油混合的溶媒来溶解生产的冻干粉，使用方便，增加冻干粉保湿美白的作用。本专利技术人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，无血清培养基培养人间充质干细胞，当细胞融合至80％左右，收集上清液。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于依次进行脐带间充质干细胞的分离、传代和收集培养上清液，培养上清液过滤浓缩，加入冻干赋形剂和50℃的去离子水，调节蛋白浓度，混匀，分装后于压强50‑100Pa，温度‑30℃‑‑35℃的冻干条件下冻干，即获得人间充质干细胞冻干粉。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于依次进行脐带间充质干细胞的分离、传代和收集培养上清液，培养上清液过滤浓缩，加入冻干赋形剂和50℃的去离子水，调节蛋白浓度，混匀，分装后于压强50-100Pa，温度-30℃--35℃的冻干条件下冻干，即获得人间充质干细胞冻干粉。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于脐带间充质干细胞的分离是取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含双抗的生理盐水保存液中，于冰盒内尽快运输；置于培养皿中剪成小段，用含双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并用眼科剪剪碎成组织块；将组织块按照合适的密度接种于培养皿中，放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁2-3h，添加适量的含FBS的DMEM/F12培养液静置于培养箱中培养，定期观察添加培养液；10d左右在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块，胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移到培养瓶中培养后进行传代。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于含双抗的生理盐水保存液为含1％双抗的生理盐水保存液，含双抗的DPBS是含1％双抗的DPBS，用眼科剪剪碎成组织块是用眼科剪将组织块剪碎至1-2mm3，含FBS的DMEM/F12培养液是含10％的FBS的DMEM/F12培养液，培养瓶是T75cm2的培养瓶，转移到培养瓶中后的细胞为P0代，密度为105/cm2。4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述传代是当培养瓶中细胞生长达到80％融合时，胰蛋白酶消化，1∶4传代培养，P3代开始使用无血清培养基培养，从P3代开始收集培养上清液。5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述收集培养上清液是3000r/min离心3min取上清，将多次收集的上清液储存于-20℃，储存作为商品超滤浓缩的细胞因子原液或者储存备用制作制人脐带间充质干细胞冻干粉。6.根据权利要求1-5任一所述制备方法，其特征在于收集的培养上清液先冷冻保存，培养上清液过滤浓缩是将收集的培养上清液于室温解冻，0.45um滤膜过滤除掉细胞，3KD的过滤膜超滤浓缩将上清液浓缩至原体积的1/10，0.22um滤膜过滤除菌，得人脐带间...

【专利技术属性】
技术研发人员：房芳，李亚平，王晶，邱丽媛，谷广其，赵进军，何文丽，
申请(专利权)人：中卫华医北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11