脐带间充质干细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种脐带间充质干细胞的培养方法。本发明专利技术脐带间充质干细胞培养方法包括如下培养步骤有：将获取的脐带组织块置于干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素6因子，且所述干细胞因子与白介素6因子的含量比为(5‑20μmol/L):(5‑20ug/ml)。本发明专利技术培养方法能够提高脐带间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种脐带间充质干细胞的培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)最早发现于骨髓，现已被证实存在于机体的多种组织器官中，是一群具有多向分化潜能的多能干细胞。目前间充质干细胞的主要来源为成人骨髓，但成人骨髓源间充质干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而逐渐减弱，且病毒感染率较高、来源受到限制。与其他来源MSCs相比，而来源于人脐带的间充质干细胞(UmbilicalcordMesenchymalStemCells，UMSCs)是一种非常有潜力的干细胞资源，与骨髓间充质干细胞相比，其资源丰富，不存在伦理道德问题，免疫原性弱，已应用于临床移植研究。但在目前实际应用过程中，脐带间充质干细胞的培养存在扩增能力有限、迁移性差等问题。干细胞的迁移性已被证实与干细胞的分化能力和损伤修复能力密切相关，因此，寻找一种新的脐带间充质干细胞培养方法以促进其增殖、提高其迁移能力是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，以解决现有脐带间充质干细胞的培养存在扩增能力有限、迁移性差等技术问题。为了实现上述专利技术目的，作为本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞的培养方法。所述脐带间充质干细胞的培养方法包括如下步骤：将获取的脐带组织块置于干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素6因子，且所述干细胞因子与白介素6因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。与现有技术相比，本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法通过在干细胞培养基中添加干细胞因子和白介素6因子，并控制两因子含量比，使得两细胞因子产生对脐带间充质干细胞生长和增殖的协效作用，从而提高脐带间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力，有效解决了传统脐带间充质干细胞培养方法存在的干细胞扩增能力有限、迁移性差的问题，为临床应用脐带间充质干细胞进行组织损伤修复提供了优良的种子。在干细胞因子和白介素6因子协效作用的基础上，通过在培养方法中增设的含有纤连蛋白包被液的包被处理，使得纤连蛋白与干细胞因子和白介素6因子之间进一步产生协效作用，从而提高脐带间充质干细胞的增殖以及迁移能力。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1为实施例1重组质粒pET-30a-rhIL-6酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；其中，M:DNAladder；1～3：质粒pET-30a-rhIL-6用NdeI和XhoI进行酶切；图2为实施例1中rhIL-6在菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6中诱导表达结果的SDS-PAGE检测图；其中，1：IPTG诱导后的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6菌体总蛋白；2：未经IPTG诱导的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-6菌体总蛋白；3：购买的商业化IL-6样本；M：蛋白质Marker；图3为实施例1中离子交换层析后的目的IL-6重组蛋白的SDS-PAGE检测图；其中，M：蛋白Marker；1：300mmolNaCl洗脱物(10ug/ml)；2：300mmolNaCl洗脱物(140ug/ml)；3：PB平衡缓冲液洗脱物；图4为实施例1-2和对比实施例1-3各实施例培养的UMSC生长曲线图；图5为实施例1和对比实施例3培养的UMSC表型流式检测图；其中图A为间充质干细胞表面抗原表达流式图，图B为造血细胞标志物表达流式图；图6为实施例1和对比实施例3培养的UMSC周期的流式检测图；其中图A为Ctr-UMSC细胞周期的流式检测图；图B为F/S/I-UMSC细胞周期的流式检测图；图C为Ctr-UMSC细胞和F/S/I-UMSC细胞周期流式检测结果统计图；图7为实施例1和对比实施例3培养的UMSC迁移性检测图；其中图A为Ctr-UMSC细胞迁移轨迹跟踪图；图B为F/S/I-UMSC细胞迁移轨迹跟踪图；图C为Ctr-UMSC细胞和F/S/I-UMSC细胞迁移平均速度统计图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。相关专业词汇说明：纤连蛋白(Fibronectin，FN)：高分子量(～440kDa)的糖蛋白细胞外基质，和细胞膜内称为整合素的受体蛋白结合。干细胞因子(StemCellFactor，SCF)：酪氨酸激酶受体c-Kit的配体。白介素6(Interleukin6，IL-6)：也被称为B细胞刺激因子2，主要由单核巨噬细胞、内皮细胞及淋巴样细胞产生，是一种多功能细胞因子。IL-6与细胞膜受体复合物相连接，该受体复合物是由可溶性的IL-6连接蛋白(IL-6R)和糖蛋白gp130组成。IL-6/IL-6R复合物诱导2分子gp130形成同型二聚体，从而引起细胞间的信号传递。。IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，是一种作用极强的诱导剂。一方面，本专利技术实施例提供了一种能够有效提高脐带间充质干细胞增殖和迁移的脐带间充质干细胞培养方法。本实施例脐带间充质干细胞培养方法含有如下步骤：将获取的脐带组织块置于干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素6因子，且所述干细胞因子与白介素6因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。在步骤中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素6因子，且控制所述干细胞因子与白介素6因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。通过在培养基中添加干细胞因子与白介素6因子，并控制两因子的含量比例，使得两因子在脐带间充质干细胞的扩增中发挥协效作用，从而提高脐带间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力。在一实施例中，控制干细胞因子在所述干细胞培养基中的浓度为5-20μmol/ml。当然在干细胞因子和白介素6因子含量比例明确的前提下，明确了干细胞因子在所述干细胞培养基中的浓度，也就明确了白介素6在所述干细胞培养基中的浓度。通过优化控制干细胞因子和白介素6在所述干细胞培养基中的浓度，能够进一步提高干细胞因子与白介素6因子的协效作用，从而进一步提高脐带间充质干细胞的扩增能力和迁移能力。在上述实施例的基础上，在一实施例中，白介素6因子为重组人IL-6，具体是以经优化后的人全长IL-6基因为靶基因进行诱导后的重组人IL-6。其中，人全长IL-6基因序列为GenBank数据库记录的人全长IL-6基因序列，所述优化后的人全长IL-6基因序列是针对GenBank数据库记录的人全长IL-6基因序列进行的优化。在具体实施例中，所述优化后的人全长IL-6基因序列如下：其中，上述重组人IL-6的诱导获得方法是以优化后的人全长IL-6基因序列为靶基因进行设计引物和相应的酶切位点，然后按照常规的方法进行转化和表达，具体是将优化后的人全长IL-6基因序列插入到原核表达载体中，获得重组质粒，再转化获得含有优化后的人全长IL-6基因序列的菌株，最后实现重组人IL-6的表达。在具体实施例中，重组人IL-6的获得方法可以但不仅仅如下文实施例1中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下培养步骤：将获取的脐带组织块置于干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素6因子，且所述干细胞因子与白介素6因子的含量比为(5‑20μmol/L):(5‑20ug/ml)。

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下培养步骤：将获取的脐带组织块置于干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素6因子，且所述干细胞因子与白介素6因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述培养处理是在被包被处理的培养器中进行，所述包被处理的包被液含有纤连蛋白。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述纤连蛋白在所述包被液中的浓度为5-20μg/mlμg/ml。4.根据权利要求2或3所述的培养方法，其特征在于：所述培养处理方法是先采用所述干细胞培养基浸润被所述包被处理的所述培养器，去掉所述干细胞培养基，再将所述脐带组织块加入所述培养器中培养2-3小时后，加入新的所述干细胞培养基直至没过所述脐带组织块进行继续培养，直至有脐带间充质干细胞爬出，待所述脐带间充质干细胞达到80-90％融合时，弃去所述脐带组织块，用胰酶-EDTA消化传代。5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于：在所述继续培养的过程中，前三天不要动培养皿，第四天开始每隔两天换一次所述干细胞培养基，直至有所述脐带间充质干细胞爬出。6.根据权利要求1-3、5任一所述的培养方法，其特征在于：所述白介素6因子是以经优化后的人全长IL-6基因为靶基因进行诱导后的重组人IL-6，所述优化后的人全长IL-6基因序列如下：5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玮，覃绍君，陈瑞华，
申请(专利权)人：海南博鳌一龄迈迪精准医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46