获得绒毛膜间充质干细胞的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了获得绒毛膜间充质干细胞的方法及试剂盒。所述获得绒毛膜间充质干细胞的方法包括：利用混合酶制剂将绒毛膜进行消化处理，得到消化产物；以及从所述消化产物中分离所述绒毛膜间充质干细胞，其中，所述混合酶制剂包括：胰酶；胶原酶Ⅳ；以及胶原酶Ⅱ。本发明专利技术的获得绒毛膜间充质干细胞的方法能够获得大量、纯度较高且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域。具体地，本专利技术涉及获得绒毛膜间充质干细胞的方法及试剂盒。
技术介绍
绒毛膜间充质干细胞与绒毛的分布密切相关，多分布于绒毛内皮下以及绒毛附近间质内。绒毛膜间充质干细胞因取材方便、操作无侵入性、多向分化潜能大、增殖能力强、免疫原性低、病原污染风险低等优点而成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。然而，目前获得绒毛膜间充质干细胞的方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前常用的绒毛膜间充质干细胞分离方法是将绒毛膜剪碎后直接用组织块法培养，或者采用酶消化法，但是酶消化方法复杂，需多次酶消化,很容易造成细胞的损伤，难以获得大量且纯度较高的绒毛膜间充质干细胞。专利技术人发现，酶消化处理过程中，酶的种类、用量、消化时间等因素显著影响酶消化处理效果，尤其是酶的种类，进而影响绒毛膜间充质干细胞的得率及活性。专利技术人经深入研究发现，单一酶的消化效果不佳，难以获得大量且纯度较高的绒毛膜间充质干细胞，而混合酶能够有效地对绒毛膜进行消化，从而获得大量、纯度较高且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。进一步地，专利技术人惊奇地发现，胰酶、胶原酶Ⅳ以及胶原酶Ⅱ的混合酶的消化效果最佳。为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种获得绒毛膜间充质干细胞的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：利用混合酶制剂将绒毛膜进行消化处理，得到消化产物；以及从所述消化产物中分离所述绒毛膜间充质干细胞，其中，所述混合酶制剂包括：胰酶；胶原酶Ⅳ；以及胶原酶Ⅱ。利用消化处理方法，能够将绒毛膜组织中细胞之间的蛋白质降解，从而分离出单个细胞。专利技术人发现，单一酶很难将绒毛膜消化完全，所得到的绒毛膜间充质干细胞量较少，由此需要进行多次消化。但是，多次消化容易造成细胞的损伤，难以获得大量且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。进而，专利技术人发现，采用混合酶制剂进行消化的效果较好，且无需多次消化，以减少对细胞的损伤。专利技术人意外地发现，采用包括胰酶、胶原酶Ⅳ以及胶原酶Ⅱ的混合酶制剂进行消化，能够获得大量、纯度较高且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。然而，利用其他种类酶的效果不佳。根据本专利技术的实施例，所述获得绒毛膜间充质干细胞的方法还可以具有下列附加技术特征：根据本专利技术的实施例，所述混合酶制剂包括：0.05质量％～0.25质量％的胰酶；1～2μg/mL的胶原酶Ⅳ；以及0.1质量％的胶原酶Ⅱ。专利技术人意外地发现，胰酶、胶原酶Ⅳ以及胶原酶Ⅱ的浓度显著影响消化效率，进而影响绒毛膜间充质干细胞的得率、纯度及活性。在上述最优混合浓度下，绒毛膜间充质干细胞的得率、纯度及活性较高。根据本专利技术的具体实施例，混合酶制剂中胰酶浓度可以为0.08质量％、0.10质量％、0.13质量％、0.18质量％或0.21质量％。当胰酶、胶原酶Ⅳ以及胶原酶Ⅱ的浓度过高，将对绒毛膜间充质干细胞造成损伤，使其活性下降，若胰酶、胶原酶Ⅳ以及胶原酶Ⅱ浓度过低，无法充分消化，从而使得到的绒毛膜间充质干细胞的得率及纯度较低。由此，根据本专利技术实施例的获得绒毛膜间充质干细胞的方法能够获得大量、纯度较高且活性较好的绒毛膜间充质干细胞。根据本专利技术的实施例，所述混合酶制剂与绒毛膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1。专利技术人发现，混合酶制剂的添加量显著影响消化处理效果，进而影响绒毛膜间充质干细胞的产率及活性。专利技术人意外地发现，当混合酶制剂与绒毛膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1时，能够获得大量、纯度较高且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。若添加量过多，容易造成细胞损伤，活性下降。在实际情况下，本领域技术人员可以根据需要选择消化处理条件，例如反应温度、时间，对此本申请不作严格限定，只要能够得到绒毛膜间充质干细胞即可。根据本专利技术的一些实施例，所述消化处理是在35～37℃的温度、100～200rpm的转速下震荡30～60min。根据本专利技术的优选实施例，所述消化处理是在37℃的温度、150rpm的转速下震荡30min。专利技术人意外地发现，在此条件下能够获得大量、纯度较高且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。消化处理温度显著影响酶活性，温度过高或过低都将造成酶活力过低，导致消化效率降低，所得到的细胞量较少。消化处理时间过长，会造成细胞损伤，使其活性降低，时间过短，酶消化不充分，所得到的细胞量较少。若震荡时间过长，将破坏细胞的结构，造成损伤。根据本专利技术的具体实施例，消化处理后，通过向消化反应体系中加入胎牛血清(FBS)，以终止消化反应。需要说明的是，对于从消化产物中分离绒毛膜间充质干细胞的方法不作严格限定，只要能够获得绒毛膜间充质干细胞即可。根据本专利技术的实施例，为了得到纯度较高的绒毛膜间充质干细胞，所述分离包括：将所述消化产物进行过滤，收集滤液；将所述滤液进行离心，收集细胞；以及将所述细胞进行清洗，以便获得所述绒毛膜间充质干细胞。由此，能够有效地除去附着于细胞上的消化液，且避免对细胞造成损伤，从而获得纯度较高且活性较强的绒毛膜间充质干细胞。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：利用混合酶制剂将裁剪成尺寸为4cm×4cm的所述绒毛膜进行消化处理，得到消化产物；将所述消化产物进行稀释，并利用100目筛网将所得到的稀释液进行过滤，收集滤液；以及将所述滤液在1200rpm的转速下离心6min，弃上清，得到所述绒毛膜间充质干细胞。专利技术人发现，将绒毛膜裁剪至尺寸为4cm×4cm，使得进行消化反应的细胞面积较大，促使消化反应充分发生。接着，将消化产物稀释，以便于后续过滤。然后将稀释液过筛，以除去大块组织。此外，将滤液在1200rpm下离心6min，既能够沉淀细胞，便于收集，同时较小地破坏细胞的结构及活性。从而，能够获得大量、纯度较高且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括扩增处理，所述扩增处理包括：将所述绒毛膜间充质干细胞重悬于培养基中，得到混合液；将所述混合液接种于所述培养基中，37℃，5％CO2下培养至出现克隆，长至传代。专利技术人发现，分离获得的绒毛膜间充质干细胞为单个细胞，将其进行扩增以得到大量的绒毛膜间充质干细胞。在上述最优扩增处理条件下，扩增的同时还可以使其活性进一步提高。在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包括：胰酶；胶原酶Ⅳ；以及胶原酶Ⅱ。根据本专利技术的具体实施例，所述试剂盒用于获得绒毛膜间充质干细胞。利用消化处理方法，能够将绒毛膜组织中细胞之间的蛋白质降解，从而分离出单个细胞。专利技术人发现，单一酶很难将绒毛膜消化完全，所得到的绒毛膜间充质干细胞量较少，由此需要进行多次消化。但是，多次消化容易造成细胞的损伤，难以获得大量且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。进而，专利技术人发现，采用混合酶制剂进行消化的效果较好，且无需多次消化，以减少对细胞的损伤。专利技术人意外地发现，采用包括胰酶、胶原酶Ⅳ以及胶原酶Ⅱ的混合酶制剂进行消化，能够获得大量、纯度较高且活性较高的绒毛膜间充质干细胞。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包括：0.05质量％～0.25质量％的胰酶；1～2μg/mL的胶原酶Ⅳ；以及0.1质量％的胶原酶Ⅱ。专利技术人意外地发现，胰酶、胶原酶Ⅳ以及胶原酶Ⅱ的浓度显著影响消化效率，进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：利用混合酶制剂将绒毛膜进行消化处理，得到消化产物；以及从所述消化产物中分离所述绒毛膜间充质干细胞，其中，所述混合酶制剂包括：胰酶；胶原酶Ⅳ；以及胶原酶Ⅱ，优选地，所述混合酶制剂包括：0.05质量％～0.25质量％的胰酶；1～2μg/mL的胶原酶Ⅳ；以及0.1质量％的胶原酶Ⅱ。

【技术特征摘要】
1.一种获得绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：利用混合酶制剂将绒毛膜进行消化处理，得到消化产物；以及从所述消化产物中分离所述绒毛膜间充质干细胞，其中，所述混合酶制剂包括：胰酶；胶原酶Ⅳ；以及胶原酶Ⅱ，优选地，所述混合酶制剂包括：0.05质量％～0.25质量％的胰酶；1～2μg/mL的胶原酶Ⅳ；以及0.1质量％的胶原酶Ⅱ。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化处理是在35-37℃的温度、100～200rpm的转速下震荡30～60min，优选地，所述消化处理是在37℃的温度、150rpm的转速下震荡30min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离包括：将所述消化产物进行过滤，收集滤液；将所述滤液进行离心，收集细胞；以及将所述细胞进行清洗，以便获得所述绒毛膜间充质干细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：利用所述混合酶制剂将裁剪成尺寸为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，岳文，贾雅丽，苏如玉，曹宁，
申请(专利权)人：华南生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44