一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用。该制备方法包括如下步骤：采用钙离子对微球分子筛MCM‑41进行钙化，钙化微球分子筛MCM‑41通过吸附DNA聚合酶经干燥得所述可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。本发明专利技术酶固定化的方法具有操作简单、催化吸附性能好、实现条件温和等优点。分别通过控制钙离子的固载和DNA聚合酶的固载，可以使固定化DNA聚合酶微球中酶的稳定性得到极显著提高，而DNA聚合酶活性基本保持不变甚至有所升高。以上优点使该固定化DNA聚合酶的微球区别于常规的酶固定化方法，在DNA聚合酶的保存、运输中节约能耗、降低成本，在分子生物学领域、生命科学等领域具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用。
技术介绍
DNA聚合酶是生物催化脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的一类酶，是DNA生物合成过程中所必须的酶复合体，具有催化DNA的合成及其相辅的活性。随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应（PCR）技术于1985年由美国Mullis专利技术诞生，并得到迅速的发展，目前已成为分子生物学、生命科学等领域及其重要的技术手段，被广泛应用于基因扩增、基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等生物领域。DNA聚合酶作为PCR技术的重要因素之一，在PCR过程中起着至关重要的作用，在某种意义上讲，PCR技术就是DNA聚合酶的技术。目前，耐热DNA聚合酶的发现使得PCR技术变得非常简捷，并且大大降低了PCR技术的成本，推动了PCR技术的发展和应用，但是目前如果长时间保持DNA聚合酶的活性，在DNA聚合酶的保存和运输仍需要在-20℃条件下进行，不仅使得其成本较高、操作和运输不便，而且酶的活性有不同程度的下降。近年来，对于其他酶类在保存、运输过程中稳定性和活性问题的研究已经有较多报道，主要是采用酶的固定化方法，但是针对DNA聚合酶鲜有报道，因此，选择合适的载体对DNA聚合酶进行固定提高其在常温下保存、运输的稳定性和活性具有极其重要的意义。目前，酶的固定化载体主要采用分子筛、硅胶、活性炭、壳聚糖等材料，分子筛作为载体材料已广泛应用于酶的固定化，新型介孔分子筛材料由于具有纳米级规则孔道、巨大的比表面积在酶催化、吸附、分离等领域具有较高的应用价值。有研究报道金属离子（钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子等）与酶形成的复合物可以使酶的稳定性得到显著提高，并且酶活性保持不变甚至有所提高。本专利技术研究的目的是开发一种用于常温保存DNA聚合酶的材料，以期解决DNA聚合酶在保存和运输中稳定性和活性差、成本高等问题，为DNA聚合酶的应用及其在分子生物学领域的发展提供思路和方法。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种钙化分子筛作为载体固定化DNA聚合酶的方法，用于DNA聚合酶的常温保存、运输，该方法具有操作简单、酶的稳定性好、活性强、回收率高等特点。本专利技术所提供的一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，所述微球材料为钙化微球分子筛材料，所述钙化微球分子筛中钙的负载量为3~10wt%。所述钙化微球分子筛的制备，采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化，获得钙化微球分子筛MCM-41。进一步的，所述钙化微球分子筛是采用钙离子对微球分子筛进行改性，钙离子来源于氯化钙、硝酸钙，微球分子筛为MCM-41分子筛（粒径为37.5~100nm、比表面积1100cm2/g、孔容1mL/g）。所述钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化的方法具体为采用等体积浸渍法，所述钙离子溶液与微球MCM-41的体积比为1:1，钙离子溶液加入煅烧过的微球MCM-41分子筛，混合，在120~180r/min、30~50℃、6~24h条件下进行磁力搅拌，收集固体产物，120℃下干燥12h得到钙化微球分子筛。所述钙离子溶液的浓度为0.75~2.50mol/L。基于所述DNA聚合酶常温保存的微球材料的DNA聚合酶常温保存方法，钙化微球分子筛对DNA聚合酶的吸附与固定，将步骤1)所得的钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶，经干燥得所述可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。进一步的，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、VentDNA聚合酶等。进一步的，所述方法还包括将DNA聚合酶配置成DNA聚合酶水溶液，即DNA聚合酶的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。进一步的，所述钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶具体为将DNA聚合酶水溶液滴加到所述的钙化微球MCM-41分子筛中，经恒温振荡固定6h后，过滤，用磷酸缓冲液反复冲洗后冷冻干燥得到固定化DNA聚合酶微球。所述DNA聚合酶水溶液与钙化微球分子筛的体积比为1:50，DNA聚合酶水溶液的浓度为0.05~0.50mol/L。本申请还包括钙离子在增强DNA聚合酶的稳定性中的应用，一定范围钙离子含量可以显著提高DNA聚合酶的稳定性，大于或者小于该含量范围，DNA聚合酶的稳定性没有变化甚至降低。有益效果：与现有技术相比，本专利技术首次公开了一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用，采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附DNA聚合酶经干燥得到可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。本专利技术所述方法具有操作简单、催化吸附性能好、实现条件温和等优点。以上优点使该固定化DNA聚合酶的微球区别于常规的酶固定化方法，在DNA聚合酶的保存、运输中节约能耗、降低成本，在分子生物学领域、生命科学等领域具有良好的应用前景。附图说明图1本专利技术实施实例1、3所制备的固定化TaqDNA聚合酶微球（A、C）与天然TaqDNA聚合酶常温下相对活性随时间的变化曲线。图2本专利技术实施实例2、4所制备的固定化TthDNA聚合酶微球（B、D）与天然TthDNA聚合酶常温下相对活性随时间的变化曲线。具体实施方式以下结合附图实施实例对本专利技术作进一步详细描述。本专利技术一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附DNA聚合酶经干燥得用于常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。实施实例1本专利技术DNA聚合酶常温保存的微球材料，采用氯化钙对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附TaqDNA聚合酶经干燥得到常温保存的固定化TaqDNA聚合酶，具体制备方法如下：（1）配制钙离子浓度为1.0mol/L的氯化钙溶液。（2）将步骤（1）的氯化钙溶液与煅烧过的微球MCM-41分子筛（孔容1mL/g）按照体积比为1:1进行等体积浸渍。（3）将步骤（2）的氯化钙和微球MCM-41分子筛混合物在150r/min、40℃条件下进行磁力搅拌12h。（4）收集步骤（3）的固体产物，120℃下干燥12h得到钙化微球分子筛。（5）配制浓度为0.20mol/L的TaqDNA聚合酶水溶液，水溶液即为pH7.0的磷酸缓冲液。（6）将步骤（5）的TaqDNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到步骤（4）钙化微球MCM-41分子筛中。（7）对步骤（6）的混合物进行恒温振荡固定6h后过滤，滤渣用磷酸缓冲液（pH7.0）反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化TaqDNA聚合酶微球。实施实例2本专利技术DNA聚合酶常温保存的微球材料，采用氯化钙对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附TthDNA聚合酶经干燥得到常温保存的固定化TthDNA聚合酶，具体制备方法如下：（1）配制钙离子浓度为1.0mol/L的硝酸钙溶液。（2）将步骤（1）的硝酸钙溶液与煅烧过的微球MCM-41分子筛（孔容1mL/g）按照体积比为1:1进行等体积浸渍。（3）将步骤（2）的硝酸钙和微球MCM-41分子筛混合物在150r/min、40℃条件下进行磁力搅拌12h。（4）收集步骤（3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，其特征在于：所述微球材料为钙化微球分子筛材料，所述钙化微球分子筛中钙的负载量为3~10wt%。

【技术特征摘要】
1.一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，其特征在于：所述微球材料为钙化微球分子筛材料，所述钙化微球分子筛中钙的负载量为3~10wt%。2.如权利要求1所述的一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，其特征在于：所述微球分子筛为微球分子筛MCM-4，粒径为37.5~100nm、比表面积1100cm2/g、孔容1mL/g。3.如权利要求1或2所述的一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，其特在于，所述钙化微球分子筛的制备方法为采用等体积浸渍法，钙离子溶液与微球MCM-41的体积比为1:1，钙离子溶液加入煅烧过的微球MCM-41分子筛，混合，在120~180r/min、30~50℃、6~24h条件下进行磁力搅拌，收集固体产物，120℃下干燥12h得到钙化微球分子筛。4.如权利要求3所述的一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，其特征在于：钙离子来源为氯化钙、硝酸钙中的一种，所述钙离子溶液的浓度为0.75~2.50mol/L。5.一种常温保存DNA聚合酶的方法，基于权利要求1所述的DNA聚合酶常温保存的微球材料，其特征在于：将...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾令文，王利华，
申请(专利权)人：武汉中科志康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42