本发明专利技术公开了一种催化DNA合成延伸能力提高的DNA聚合酶，属于酶工程领域。本发明专利技术以来源于Sulfolobus solfataricus的野生型Dpo4为基础，构建突变体获得DNA持续合成能力增强的DNA聚合酶Dpo4。Dpo4 A181D的延伸长度相比野生型Dpo4，增加了25％，Dpo4 E63K较Dpo4增加了18.75％。Dpo4 A181D和Dpo4的保真性接近，Dpo4 E63K的保真性相比Dpo4和Dpo4 A181D有所提高。总的来说，本发明专利技术筛选获得的突变体A181D、E63K的持续合成能力提高，这些改造后的Dpo4以及携带该酶的试剂盒将对基因工程的操作产生重要积极作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种催化DNA合成延伸能力提高的DNA聚合酶，属于酶工程领域。
技术介绍
Y-家族DNA聚合酶Dpo4是一类跨损伤合成聚合酶（TLS），它能够代替复制性DNA聚合酶跨越模板损伤处使得DNA合成继续，从而帮助细胞抵抗DNA损害。但为了防止出现更多突变，跨越损伤后Dpo4会被立即切除，正常的复制性聚合酶会恢复对DNA合成的控制，这就要求Dpo4与DNA的结合是短暂的。Dpo4是典型的Y-家族DNA聚合酶，具有典型的右手结构，分为拇指（thumb）、手掌（palm）、手指（finger）、小手指（little-finger）四个结构域，相比其它DNA聚合酶，Dpo4的手指域很小，导致与新生碱基对的大沟几乎没有接触，另外它的拇指域短而粗，使得Dpo4与DNA及掺入核苷具有较少的作用，总的来说，Dpo4对其DNA底物施加的约束很少。它的结构特点和功能要求决定了Dpo4有着较低的持续合成能力。持续性合成能力的本质是在多轮催化中保留酶对聚合底物的亲和性，因此，提高聚合酶对底物的亲和力才是提高持续合成能力的本质途径。在已有的研究中提高聚合酶延伸能力主要是通过在聚合酶上连接相应的结合蛋白，如β-滑动夹子，硫氧还蛋白，PCNA以及来自于Sulfolobussolfataricus的Sso7d蛋白。通过突变氨基酸来增强聚合酶与DNA的亲和力的研究主要在一些HIV病毒的逆转录酶的研究中有所体现，而关于Y-家族DNA聚合酶的研究很少。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dpo4，主要是通过定点突变将Dpo4第181位的氨基酸A突变为D，或将第63位的E突变为K得到。所述持续合成能力是指DNA聚合酶一次结合使DNA延伸的平均长度。所述第181位氨基酸A、第63位的氨基酸E均为非保守位点。编码野生型Dpo4的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，野生型Dpo4的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dpo4的方法，是通过分子动力学手段理论模拟Dpo4与DNA的结合能，然后定点突变的实验方法获得突变体。本专利技术以来源于Sulfolobussolfataricus的野生型Dpo4为基础，构建突变体获得DNA持续合成能力增强的DNA聚合酶Dpo4。突变体的持续合成能力方面，Dpo4A181D的延伸长度相比野生型Dpo4，增加了25%，Dpo4E63K较Dpo4增加了18.75%。Dpo4A181D和Dpo4的保真性接近，Dpo4E63K的保真性相比Dpo4和Dpo4A181D有所提高。总的来说，本专利技术筛选获得的突变体A181D、E63K的持续合成能力提高，这些改造后的Dpo4以及携带该酶的试剂盒将对基因工程的操作产生重要积极作用。附图说明图1Dpo4蛋白的表达及纯化，“1”代表蛋白Marker，“2”代表未经诱导的粗酶液，“3”代表经过IPTG诱导的粗酶液，“4”、“5”分别表示经过镍柱纯化和阳离子交换柱进一步纯化得到的蛋白。图2Dpo4野生型酶与突变体酶的持续合成能力图3Dpo4野生型酶及突变体的保真性比较图4Dpo4野生型酶及突变体的核苷酸掺入效率比较具体实施方式实施例1Dpo4蛋白的表达和纯化通过生物公司（苏州泓迅）合成核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Dpo4目的基因，酶切连接构建重组质粒pET28a-dpo4，转化至E.coliBL21菌株表达，pET28a含有组氨酸标签，表达后蛋白可以通过Ni-NTA重力柱进行初步纯化，后利用阳离子交换柱Mono-S纯化至条带均一，并进行SDS-PAGE检测目的蛋白纯度。纯化后的Dpo4小样品-80℃保存在50mMTris-HCl缓冲液中(pH7.7at22℃)，该缓冲液含有50mMNaCl、1mM二硫苏糖醇和50%甘油(v/v)。蛋白表达及纯化的结果如图1所示，由条带2、3可以看出E.coliBL21在经过诱导后才会表达出Dpo4，不存在本底表达，由“5”可知，经过两步纯化后，目的蛋白以单一条带存在。实施例2突变位点的确定通过同源序列比对，确定了Dpo4序列中的非保守位点以及这些位点的突变方向及频率。结果如表1所示，确定了F33Y、F37T、I59M、E63K、M76I、A181D、N188S、A220S、I248Y、V289I共十个突变方向，利用计算机模拟这十个突变体Dpo4与DNA的结合及结合自由能计算。结果如表2所示，理论上结合自由能降低意味着Dpo4与底物的结合更为稳定，也就说明酶与底物的亲和力更大，从而酶的持续合成能力提高，从表2分析可知，除了F37T和A220S外其余突变都能增强持续合成能力。表1.非保守氨基酸的突变残基种类及频率表2.Dpo4及其突变体与DNA复合物的结合自由能实施例3Dpo4突变酶构建及持续合成能力比较通过定点突变分别构建10个突变体Dpo4F33Y、Dpo4F37T、Dpo4I59M、Dpo4E63K、Dpo4M76I、Dpo4A181D、Dpo4N188S、Dpo4A220S、Dpo4I248Y、Dpo4V289I，编码野生型Dpo4的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，野生型Dpo4的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。通过引物延伸实验来评价Dpo4及其十个突变体的持续合成能力。恒定浓度（10nM）的退火好的荧光标记引物/模板添加到反应缓冲液（10mMHEPESNaOH（pH7.4），50mMNaCl，10mMMgCl2，200mMdNTPs，1mMDTT，100μg/mlBSA和0.1%的TritonX-100）。100nM的Dpo4及其突变体酶在37℃启动DNA的合成，并以5000倍过量于底物的50-mer单链序列作为Trap，控制酶只一次结合于DNA。孵育5min后，加入10μL终止液淬灭（80%甲酰胺，1mg/mL二甲苯C，1mg/mL溴酚蓝，20mMEDTA），反应产物在95℃变性5分钟，置冰10min。反应混合物在20%的Urea-PAGE分离，再由TyphoonTrio扫描凝胶。结果如图2所示，持续合成能力可以定义为平均延伸的条带长度，由图2A可知，Dpo4及突变体延伸的主要条带的含量存在明显差异，根据延伸条带荧光值占总延伸的比例，进行加权平均计算DNA聚合酶一次结合DNA延伸的平均长度，并作为衡量持续合成能力的标准可以得到野生型Dpo4的持续合成能力为16nt，与已有的文献数据接近，在已有的文献中当酶比DNA过量20倍时往往能延伸50-100左右的片段，但可以认为是由于不含有Trap而造成的聚合酶重新结合。本实施例中由于Trap的存在，且Dpo4只10倍过量于DNA，因此认为在37℃下，酶10倍过量于DNA时，Dpo4的持续合成能力为16nt。根据野生型Dpo4的平均长度计算方法计算出所有突变体的平均延伸的条带长度（图2B），其中Dpo4A181D的延伸长度最长，相比野生型Dpo4，延伸长度增加了25%，Dpo4E63K较Dpo4增加了18.75%，Dpo4V289I、Dpo4A220S、Dpo4M76I、Dpo4F37T的延伸长度相比Dpo4下降，其中Dpo4V289I相比Dpo4下降最为明显下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dpo4，其特征在于，将Dpo4第181位的氨基酸A突变为D，或将第63位的E突变为K得到，野生型Dpo4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dpo4，其特征在于，将Dpo4第181位的氨基酸A突变为D，或将第63位的E突变为K得到，野生型Dpo4的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶Dpo4，其特征在于，编码野生型Dpo4的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种获得权利要求1或2所述持续合成能力增...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，王立，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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