一种人脐带血免疫细胞库的构建方法技术

一种人脐带血免疫细胞库的构建方法，包括：脐带血的采集及运输；从脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞内的CD34

Construction method of human cord blood immune cell bank

A method for constructing an immune cell bank of human cord blood comprises the collection and transportation of cord blood, isolation of mononuclear cells from umbilical cord blood, and the incorporation of CD34 in mononuclear cells

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带血免疫细胞库的构建方法
本专利技术涉及一种细胞库的构建方法，尤其涉及一种人脐带血构建免疫细胞库的方法。
技术介绍
免疫细胞，泛指所有参与免疫反应的细胞，也特指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞。免疫细胞治疗是采集人体免疫细胞，在多种免疫活性因子的作用下，经过体外培养，大量扩增免疫效应细胞后，再回输到体内，杀灭血液及组织中的病原体和癌细胞。目前，用于临床治疗的免疫细胞主要有树突状细胞（DC）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、DC刺激的CIK细胞（DC-CIK）、自然杀伤细胞（NK）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）等。免疫细胞治疗已成为继手术、化疗、放疗三大传统疗法后的第四种肿瘤治疗技术，弥补了手术、放化疗等常规疗法无法完全杀灭体内残余癌细胞的缺点，还能防止肿瘤复发与转移，达到控制甚至治愈癌症的目的，在临床上的使用越来越广泛。目前，临床上的免疫细胞治疗均是将血液中分离的单个核细胞诱导扩增成足量的免疫细胞后回输。而这种治疗方式存在几个不可避免的问题：（1）由于釆血后的单个核细胞分离及诱导培养，病人若选择免疫细胞治疗至少需等待两周时间，容易错过最佳治疗期，且住院时间延长；（2）癌症患者尤其是晚期癌症患者，体质虚弱、免疫功能低下，一般不能耐受反复抽血（如容易诱发缺血性贫血等），因此所得的自体血量较少，而一次培养只能扩增70-80倍左右，难以满足免疫细胞治疗所需细胞数量，临床医生需在细胞治疗和反复抽血之间平衡；（3）病人自体血液的质量不高，尤其是抗原递呈细胞（DC细胞即是最高效的抗原递呈细胞）数量较少，而免疫抑制细胞（Treg细胞）数量较多，诱导培养时免疫抑制细胞数量也在不断增加，将在一定程度上继续抑制效应细胞；（4）临床上的免疫细胞治疗（DC-CIK）多选用全抗原负载的模式（如CN102861107B），治疗的靶向性不强，存在移植物抗宿主反应的风险。脐带血是脐带及胎盘内近胎儿一侧血管内的血液，来源充足，采集方便，免疫源性较弱，能更大程度上耐受HLA（人类的主要组织相容性复合体）配型不服；脐带血内的淋巴细胞绝对数量高，具有较强的增殖潜力；由脐带血分离诱导后进行免疫细胞治疗，可突破免疫细胞只进行自体治疗的瓶颈，满足不同人群对细胞治疗的需求。在免疫细胞库建设过程中还需考虑细胞冻存的问题，目前的细胞冻存液中DMSO（二甲基亚砜）的含量一般均在10%-15%，即便是在冻存免疫细胞的专利（CN102758259B）中，依然将DMSO控制在10%。但是单个核细胞，尤其是诱导后的淋巴细胞是脆弱的，由于DMSO的毒性作用及冻存过程中的机械操作，易造成免疫细胞膜上的某些蛋白构型的改变，从而引起细胞亚型变化，导致穿孔素分泌量下降；另一方面，细胞在复苏处理时还需注意对DMSO的清除处理，已有报道指出细胞治疗的不良事件发生率与DMSO的回输量有关。综上所述，研究一种可以满足临床中细胞治疗需要的免疫细胞库的构建方法，显得尤为重要。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种人脐带血构建免疫细胞库的方法，该方法可提高细胞质量，增强细胞治疗效果。为实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供一种人脐带血免疫细胞库的构建方法，该构建方法包括以下步骤。步骤1、脐带血的采集及运输。步骤2、从脐带血中分离单个核细胞。步骤3、将步骤2得到的单个核细胞内的CD34＋细胞诱导成DC细胞：用AIM-V培养基调整单个核细胞密度；然后接种至培养瓶中，同时加入DC诱导因子，置二氧化碳培养箱中进行培养；培养至第2-3天时，加入rhGM-CSF、rhIL-4和rhIL-15，置二氧化碳培养箱继续培养。步骤4、从上清培养液中分离悬浮的淋巴细胞：步骤3培养的细胞培养至第3-4天时，将培养液转至无菌离心管中，再往培养瓶中加入生理盐水，晃动洗涤，收集残留悬浮的淋巴细胞。步骤5、获得成熟的DC细胞：向步骤4洗涤后的培养瓶中加入AIM-V培养基，加入rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhGM-CSF和rhIL-4，置二氧化碳培养箱，继续培养贴壁细胞；当培养至第6天时，半量换液，回收移出液中的悬浮细胞，补充rhGM-CSF和rhIL-4，并加入单一特异性肿瘤抗原肽进行负载，置二氧化碳培养箱中，继续培养；当培养至第7天时，加入rhTNF-α，置二氧化碳培养箱，继续培养；当培养至第9天时，细胞变为毛刺状悬浮细胞，即为成熟的DC细胞，终止培养。步骤6、获得CIK细胞：将步骤4中的悬浮的淋巴细胞离心弃上清，用AIM-V培养基调整细胞密度后，接种到培养袋中，加入IFN-γ混匀，置二氧化碳培养箱培养；培养24h后，加入rhIL-2、rhIL-15、CD3；然后每2-3天，2倍量添加培养液AIM-V培养基,并补加rhIL-2；当培养至第7天时，将培养袋内的悬浮细胞转移到WAVEBioreactorsystem10中，继续进行培养8天，获得CIK细胞。步骤7、收集DC-CIK细胞：将步骤5得到的成熟的DC细胞离心，用AIM-V培养基重悬细胞，加入WAVEBioreactorsystem10中，与步骤6培养至第8天得到的悬浮细胞（CIK细胞）共培养；然后再添加AIM-V培养基，并补加rhIL-2、rhIL-15；共同培养至第14-16天时，离心收集共培养的细胞，即为DC-CIK细胞。步骤8、对收集的DC-CIK细胞进行检测。步骤9、检测合格后，放入免疫细胞库冻存，并建立细胞档案：将检测合格的DC-CIK细胞与预冷的细胞冻存液混合后封装，附上标签，转至液氮罐内。步骤10、根据临床诊断从免疫细胞库内选择对应的效应细胞种类，复苏培养24h后，回输。所述步骤1中脐带血采集后需加入抗凝剂；所述的抗凝剂为肝素或枸橼酸钠。所述步骤3中采用的DC诱导因子为rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhIL-3和rhIL-11，各诱导因子的用量均为5-100ng/ml。所述步骤5中肿瘤抗原肽是针对各种肿瘤疾病的特异性抗原肽，优选CEA癌胚抗原、AFP甲胎蛋白。所述步骤5中获得的成熟DC细胞是针对单一肿瘤抗原肽的效应细胞。所述步骤9中细胞冻存液的配方为5%DMSO，10%羟乙基淀粉，85%稳定剂；其中稳定剂由25%人血白蛋白，5%乙二醇，70%培养基组成；羟乙基淀粉可用右旋糖酐40代替。所述步骤9细胞档案需详细记录抗原肽负载类型；细胞档案需建立电子版档案和纸质版档案。所述步骤9免疫细胞库是针对不同肿瘤抗原肽的多种效应细胞的集合。所述步骤9冻存的细胞密度控制在1-5×108/ml。所述步骤10细胞复苏培养需加入rhIL-2、rhIL-6、rhIL-15进行培养。本专利技术的有益效果。本专利技术提供的人脐带血免疫细胞库的构建方法，采用人脐带血作为免疫细胞库的细胞来源，不仅活性高，扩增速度快，而且脐带血中含有丰富的造血干细胞，可塑性好，免疫原性低，大量实践证明脐带血来源的造血干细胞可帮助白血病患者完成造血和免疫功能的重建，采用人脐带血作为免疫细胞库的细胞来源，在保证血源充足的同时，既可避免采血给病人带来的痛苦，又可提高细胞质量（脐带血内的淋巴细胞绝对数量高，增值潜力强，且不存在免疫抑制细胞），增强细胞治疗效果。本专利技术与现有的构建方法相比，本专利技术构建方法的构建速度快，且通用性好。构建的免疫细胞库是各种肿瘤抗原肽效应细胞的集合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脐带血免疫细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、脐带血的采集及运输；步骤2、从脐带血中分离单个核细胞；步骤3、将单个核细胞内的CD细胞诱导成DC细胞；步骤4、分离悬浮的淋巴细胞和贴壁的DC细胞；步骤5、选择肿瘤抗原肽对DC细胞进行抗原负载，获得成熟的DC细胞；步骤6、对悬浮的淋巴细胞进行培养，获得CIK细胞；步骤7、将成熟的DC细胞加入CIK细胞内进行大规模共培养，然后收集DC‑CIK细胞；步骤8、对收集的DC‑CIK细胞进行检测；步骤9、检测合格后放入免疫细胞库冻存，并建立细胞档案；步骤10、根据临床诊断从免疫细胞库内选择对应的效应细胞种类，复苏培养24h后回输。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带血免疫细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、脐带血的采集及运输；步骤2、从脐带血中分离单个核细胞；步骤3、将单个核细胞内的CD细胞诱导成DC细胞；步骤4、分离悬浮的淋巴细胞和贴壁的DC细胞；步骤5、选择肿瘤抗原肽对DC细胞进行抗原负载，获得成熟的DC细胞；步骤6、对悬浮的淋巴细胞进行培养，获得CIK细胞；步骤7、将成熟的DC细胞加入CIK细胞内进行大规模共培养，然后收集DC-CIK细胞；步骤8、对收集的DC-CIK细胞进行检测；步骤9、检测合格后放入免疫细胞库冻存，并建立细胞档案；步骤10、根据临床诊断从免疫细胞库内选择对应的效应细胞种类，复苏培养24h后回输。2.如权利要求1所述的人脐带血免疫细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤3为：用AIM-V培养基调整单个核细胞密度，然后接种至培养瓶中，同时加入诱导因子，置二氧化碳培养箱中进行培养；培养至第2～3天时，加入rhGM-CSF、rhIL-4或rhIL-15，置二氧化碳培养箱继续培养。3.如权利要求1所述的人脐带血免疫细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤4为：培养至第3-4天时，将培养液转至无菌离心管中，再往瓶中加入生理盐水，晃动洗涤，收集残留贴壁细胞。4.如权利要求1所述的人脐带血免疫细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤5为：向培养瓶中加入AIM-V培养基，加入rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhGM-CSF和rhIL-4，置二氧化碳培养箱继续培养贴壁细胞；当培养至第6天时，半量换液，回收移出液中的悬浮细胞，补充rhSCF和rhFLT-3L，并加入单一特异性肿瘤抗原肽进行负载，置二氧化碳培养箱中继续培养；当培养至第7天时，加入rhTNF-α，置二氧化碳培养箱继续培养；当培养至第9天时，细胞变为毛刺状悬浮细胞，即为成熟的DC细胞，终止培养。5.如权利要求1所述的人脐带血免疫细胞库的构建方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳松，
申请(专利权)人：沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21