本发明专利技术涉及3,3’‑二吲哚甲烷（3,3′‑diindolylmethane，DIM）提高脐带间质干细胞旁分泌和治疗皮肤损伤的用途，属于中药用途技术领域；具体涉及的是DIM能够提高提高脐带间质干细胞的旁分泌和治疗皮肤烧伤修复的效果；本发明专利技术所述的DIM对可以使脐带间质干细胞的干细胞特性得到显著地的提升，提高其向其他类型细胞分化的能力，同时可以促进脐带间质干细胞IL‑6、IL‑8、G‑CSF等旁分泌因子的增加，最终提高脐带间质干细胞在皮肤烫伤中的修复作用，这一发现拓展了DIM的应用范围，提高了脐带间质干细胞促进皮肤组织再生的能力，具有广阔的临床应用前景。
3,3 'two diindolymethane to improve the use of human umbilical cord mesenchymal stem cells paracrine and treatment of skin injury
The present invention relates to 3,3 'two diindolymethane (3,3' diindolylmethane, DIM) to improve the use of human umbilical cord mesenchymal stem cell paracrine and treatment of skin injury, which belongs to the technical field of medicine use; in particular to DIM can improve the human umbilical cord mesenchymal stem cells paracrine and treatment of skin burn repair effect of the invention; the DIM of the umbilical cord mesenchymal stem cells have significant characteristics of stem cells increase, improve its ability to other types of cell differentiation, and can promote human umbilical cord mesenchymal stem cells increased IL 6, IL 8, G CSF paracrine factors, and ultimately improve the human umbilical cord mesenchymal stem repair cells in skin burns, this finding extends the application scope of DIM, improve the ability of human umbilical cord mesenchymal stem cells to promote tissue regeneration of the skin, have broad prospects in clinical application.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及3,3’-二吲哚甲烷（3,3′-diindolylmethane，DIM）提高脐带间质干细胞旁分泌和治疗皮肤损伤的用途，属于中药用途
技术介绍
皮肤损伤是日常生活常见的一种创伤。皮肤损伤也是常见的战伤之一，占战伤的10%-30%，在核战争中的可达到90%。烧烫伤具有高发病率和死亡率。目前大面积的皮肤损伤治疗主要通过全身支持治疗、创面的清理及结痂切除和外科植皮等方法，传统的治疗方法虽然有一定效果但其结痂深度难于把握、皮源紧张和易感染的问题有待解决。近年来，以干细胞特别是间质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）为基础的皮肤再生医学研究得到广泛关注，研究表明MSC主要旁分泌促生长的细胞因子进而促进皮肤创伤的修复，在烧烫伤的修复中具有广阔的临床应用前景。然而，MSC注射体内后治疗效果受其存活率和旁分泌生长因子多少的影响，因此试图提高MSC细胞的旁分泌能力和增殖扩增能力是进一步提高其治疗效果的关键。目前提高细胞干性和促再生能力的主要是通过基因改造的方法，但是基因编辑的不确定性导致其改造后的干细胞具有安全性的问题。近年来，通过药物刺激来达到改造干细胞的研究越来越引起人们的重视。3,3’-二吲哚甲烷（DIM）提取自十字花科蔬菜的天然化合物，它是吲哚-3-甲醇（I3C）的体内二聚产物，属于吲哚芥子油苷的一种。目前对DIM的研究主要集中在其肿瘤治疗的作用，其抗肿瘤的机制包括：调控肿瘤细胞的凋亡、增殖、细胞周期及肿瘤细胞中关键的信号通路。在组织再生方面，DIM具有促进肝脏和急性肺损伤修复的作用，但是，申请人前期的研究表明，低浓度的DIM具有促进胃癌细胞生长的作用，因此直接应用DIM存在着安全性的副作用，由此寻找一种既能体现DIM的促组织再生作用又能防止其副作用的方法是十分必要的。本专利技术首次将DIM作用于脐带间质干细胞，发现DIM预处理的脐带间质干细胞具有更好的旁分泌和促进皮肤烫伤修复的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷而提供一种能够提高人脐带间质干细胞特性和旁分泌作用的新方法和新药物。经验证，DIM具备能够促进hucMSC向脂肪细胞和骨细胞分化的能力，能够促进hucMSC细胞分泌IL-6、IL-8、Wnt11等促进皮肤组织再生的因子的作用。本专利技术涉及的DIM预处理的脐带间质干细胞具有更好促进皮肤烫伤修复的作用。实验证明DIM刺激后的脐带间质干细胞更好地促进大鼠皮肤烫伤的创面愈合、更好地促进其表皮的再生化、皮肤细胞增殖再生能力等作用，具有极佳的临床应用价值。本专利技术涉及的DIM对脐带间质干细胞预处理的步骤具体操作如下：（1）脐带间质干细胞的原代培养：依据已经建立的脐带来源间质干细胞的方法进行分离培养，并进行多向分化和流式指标的鉴定（QiaoChunetal.Humanmesenchymalstemcellsisolatedfromtheumbilicalcord.CellBiolInt.2008Jan;32(1):8-15.）（2）应用二甲基亚砜（DMSO）对DIM进行稀释（DIM为疏水性药物，需要DMSO进行助溶），稀释到500mM浓度的母液，后将此浓度的DIM再应用DMEM细胞培养液（含有胎牛血清）进行稀释到应用浓度；（3）种脐带间质干细胞于培养器皿中，细胞密度在40%左右，将DMEM细胞培养液稀释好的DIM溶液作用脐带间质干细胞48h后即可得到DIM预处理的脐带间质干细胞，将处理的间质干细胞消化收集即可进行下一步分析和应用。本专利技术提供的是一种能够提高脐带间质干细胞治疗皮肤损伤治疗效果的新方法，这里所述的皮肤损伤是烧烫伤；本专利技术涉及的是DIM这种抗肿瘤药物的新应用；在一具体实例中，DIM能够提高人脐带间质干细胞特性和旁分泌作用；在一具体实例中，DIM预处理的脐带间质干细胞可以更好地促进烧烫伤皮肤的创面愈合，表皮的再生化。本专利技术的有益效果：由上述提取方法不难发现，本专利技术涉及的是DIM的新应用，与现有直接进行hucMSC移植治疗皮肤烫伤相比较，本专利技术具有以下的特点：应用DIM预处理的hucMSC较未处理的MSC细胞具有更强的旁分泌作用，促进hucMSC细胞旁分泌促组织再生的相关因子，DIM刺激后hucMSC的干细胞分化能力得到显著地提高，具体表现在其干细胞的成脂成骨分化能力更强，干细胞相关基因Oct4、Nanog、Sall4、Sox2的表达呈显著上调，也就是其干细胞特征更加明显；更重要是，DIM刺激后的hucMSC治疗皮肤烧伤的效果更加明显，具体表现为，DIM刺激的hucMSC细胞创面愈合的速度、表皮再生化及组织细胞的增殖能力均优于对照hucMSC，以上的内容提示通过DIM处理的hucMSC细胞拥有更好的组织再生能力，因此本专利技术具有重要的临床意义。附图说明图1为DIM作用脐带间质干细胞的作用浓度的确定结果。图2为DIM促进脐带间质干细胞增殖结果；图中A为平皿中未经DIM刺激（左）和DIM刺激后（右）的脐带间质干细胞形成的克隆数量和大小；B为形成的克隆数量柱形图。图3为DIM促进脐带间质干细胞干性转录因子Sall4、Nanog、Oct4、Sox2在mRNA（图A）和蛋白（图B）水平的表达结果。图4为DIM对脐带间质干细胞成骨成脂分化的检测结果。图5为定量PCR分析DIM对脐带间质干细胞中Adipo（脂肪细胞的标记基因，图A）和骨细胞的标记基因（ALP，图B）的表达影响结果。图6为luminex分析DIM对脐带间质干细胞13种重要旁分泌因子的表达影响（100倍）结果。图7为DIM预处理的脐带间质干细胞治疗SD大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型的促修复作用的示意图。图8为3个不同组大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤创面的大体照片（图A）和HE染色（图B）的结果。图9为对损伤组织应用DIM预处理的hucMSC治疗后，进行PCNA组织化学染色的结果；图10为免疫荧光对损伤后皮肤组织中CK19（皮肤表皮层的标记蛋白）的表达进行染色的结果。具体实施实例以下结合具体实施例对本专利技术更好的阐述，以便与对本专利技术更好的理解。实施例1：DIM能够提高脐带间质干细胞的干细胞特性和旁分泌功能。本实施例所使用的主要材料和来源分别如下：MSC培养试剂：低糖DMEM（Gibco公司产品）、胎牛血清（Gibco公司产品）、胰蛋白酶（Sigma公司产品）、二氧化碳培养箱(Forma公司)、无血清培养基（上海依科赛公司）、RNA逆转录试剂盒（南京诺维赞）、蛋白提取试剂盒（碧云天）、间质干细胞成脂诱导液和成骨诱导液（广州赛业公司）、Luminex细胞因子检测试剂（美国Millipore）。倒置显微镜、生物显微镜、超净工作台、台式离心机、Biorad定量PCR仪、Luminex检测设备均来源于美国Millipore公司；DIM药物（美国Sigma公司）、6或24孔培养板（Corning公司）、定量PCRmix（南京诺维赞公司）、定量PCR排管（Biorad公司）、Westernblot相关试剂、成脂诱导液（广州赛业公司）、成骨诱导液（广州赛业公司）、Luminex检测试剂（美国Millipore公司）；Sall4抗体（美国Abcam公司）、Oct4抗体（美国SAB公司）、Sox2抗体（美国Millipore公司）、GA本文档来自技高网...
【技术保护点】
3,3’‑二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞的干细胞特性中的应用。
【技术特征摘要】
1.3,3’-二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞的干细胞特性中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为提高脐带间质干细胞的转录因子的表达。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为提高脐带间质干细胞向脂肪和骨细胞分化的能力。4.3,3’-二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞的旁分泌的应用。5.3,3’-二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞在制备治疗皮肤损伤药物效果的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述皮肤损伤为烧伤或烫伤。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述烫...
【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，史惠，许文荣，钱晖，潘昭吉，尤本帅，杨伦宇，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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