提高脐带干细分化为心肌细胞效率的一种方法技术

本发明专利技术属于生物细胞技术领域，具体涉及一种提高脐带干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的方法。本发明专利技术在脐带干细胞心肌细胞定向诱导分化培养液中加入特定浓度的碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1，得到了约50-70％的心肌样细胞，较单纯5-氮胞苷诱导(分化效率约30％)，分化效率明显提高。因为心肌细胞体外增殖能力有限，无法满足体外构建组织工程心肌的需要，本发明专利技术提供了一个新的快速获取心肌细胞的方法；也可为心肌细胞损伤后提供补充来源，为干细胞移植治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基础，具有很好的临床应用前景。

A method to improve the efficiency of umbilical cord mesenchymal stem cells differentiating into cardiomyocytes

The invention belongs to the technical field of biological cells, in particular to a method for improving the directional differentiation of umbilical cord stem cells into cardiomyocytes in vitro. The present invention in umbilical cord stem cells directional myocardial cell differentiation into specific concentration in the solution of basic fibroblast growth factor and transforming growth factor beta 1, the myocardial cells of about 50-70%, compared with 5- (5-azacytidine-induced differentiation efficiency of about 30%), significantly improve the efficiency of differentiation. Because of the proliferation of cardiomyocytes in vitro ability is limited, unable to meet the needs of the construction of tissue engineering heart in vitro, the invention provides a quick access to the new method of myocardial cells; can also provide supplementary source for myocardial cell injury, which laid the foundation for the heart function of stem cell transplantation for treatment of myocardial infarction and late insufficiency, has clinical application good prospects.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于生物细胞
，具体涉及一种提高脐带干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的方法。
技术介绍
：在心脏外科领域，目前使用的各种补片、管道都没有生长能力，无法辅助心脏功能，远期还会出现感染、血栓形成、毁损等。同时，冠状动脉粥样硬化性心脏病发病率高，心肌梗死后再生能力非常有限，因此寻找一种新的更好的治疗手段已成为临床及基础研究热点，细胞移植或体外构建组织工程心肌将是一个很有前景的治疗选择。脐带干细胞易于获取，体外增殖分化能力强，利用脐带干细胞分化来的心肌细胞体外构建组织工程心肌，植入后能与机体发生电机械耦连，并且能够随机体生长而生长，是非常理想的细胞来源。基于此，我们采用酶消化法，成功从脐带组织中分离出干细胞(武开宏，莫绪明，刘迎龙，卢士红，韩忠朝。酶消化法分离脐带干细胞。中华小儿外科杂志。2008；29(3)：159-162)。我们研究发现，在诱导剂5-氮胞苷(5μmol/L)的作用下，脐带干细胞能够分化为心肌细胞，但是分化效率较低，只有约30％的脐带干细胞能够分化为心肌细胞(武开宏，莫绪明，卢士红，周斌，韩忠朝。脐带干细胞分化为心肌细胞样的实验研究。中华小儿外科杂志2009；30(10)：33-6)。仍然无法满足体外组织工程心肌研究的需要。进一步，我们经实验研究发现在诱导剂中加入碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1，能明显提高脐带干细胞分化为心肌细胞的效率，分化效率由30％提高到50-70％，为体外组织工程心肌研究提供了一个新的快速获取心肌细胞的方法，也可为心肌细胞损伤后提供补充来源，为干细胞移植治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基础，具有很好的临床应用前景。
技术实现思路
：采用胶原酶消化法分离脐带干细胞。取培养分离的脐带干细胞，接种于24孔培养板，心肌细胞诱导分化液含DF12培养基，胎牛血清和5-氮胞苷。4周后，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测心肌特异性基因肌钙蛋白T，免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性肌球蛋白Myosin抗体和连接蛋白Connexin43抗体及细胞透射电镜检查。在心肌诱导培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1，采用免疫细胞化学方法检测细胞分化效率，并与单纯心肌细胞诱导进行对比研究。同时确定诱导分化时间，为实际应用中的浓度和时间提供参考基础。确定可以用20ng/ml浓度的碱性成纤维细胞生长因子和2.5ng/ml转化生长因子-β1，能够明显提高脐带干细胞分化为心肌细胞的效率。本专利技术为体外组织工程心肌研究提供了一个新的快速获取心肌细胞的方法，也为缺血性心血管疾病的细胞治疗研究，提供了重要的实验依据资料。本
技术实现思路
未公开发表，本领域的相关技术人员如不花费创造性劳动根本不可能根据现有的技术推断得到本专利技术的诱导培养方法。附图说明：图1：分离培养的脐带干细胞，细胞增殖能力旺盛，呈旋涡状生长。图2：诱导2周后，细胞的形态不断发生变化一些细胞的体积增大，空泡样改变。图3：4周后，免疫细胞化学染色显示心肌特异性肌球蛋白阳性，诱导分化效率30％。图4：加入碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1，免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌球蛋白示心肌细胞分化效率为50-70％。具体实施方式：实施例1.脐带干细胞的培养、鉴定及心肌细胞分化取无污染的足月剖宫产健康胎儿脐带，采用酶消化法分离脐带干细胞并进行鉴定。流式细胞分析脐带干细胞表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105、CD166和MHC-I，而不表达CD31、CD34和CD106，MHC-II。诱导前脐带干细胞形态成典型的成纤维样细胞形态，诱导2周后，细胞的形态不断发生变化一些细胞的体积增大，空泡样改变。取培养分离的脐带干细胞，以5×104/cm2细胞接种在T25培养瓶中，6h后细胞贴壁，按5μmol/L加入诱导剂5-氮胞苷，孵育24h，之后去除诱导培养基，以PBS溶液充分冲洗2次，改普通培养基继续培养，培养基组成：DF12培养基，5％胎牛血清，10μg/ml胰岛素，100U/ml青、链霉素，5ng/ml表皮生长因子。细胞达80-90％融合后，进行传代培养，连续培养4周。4周后，RT-PCR检测心肌特异性肌钙蛋白T基因阳性，免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性肌球蛋白Myosin抗体和连接蛋白Connexin43抗体阳性，心肌细胞分化效率为30％，细胞透射电镜检查示细胞质膜下及胞质中有散在小片或小束微肌丝样结构出现。实施例2.提高脐带干细胞的心肌细胞分化效率在心肌细胞诱导培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1，培养方法同实施例1，实验发现诱导分化后的脐带干细胞表达心肌特异性肌球蛋白Myosin抗体和连接蛋白Connexin43抗体，检测发现心肌细胞分化的效率提高到50-70％。同时，确定可以用20ng/ml浓度的碱性成纤维细胞生长因子和2.5ng/ml转化生长因子-β1来提高脐带干细胞分化为心肌细胞的效率。本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术专利其特征是通过下列步骤进一步提高脐带干细胞体外诱导分化为心肌细胞的效率：1)分离、培养脐带干细胞并进行鉴定。2)采用诱导剂5‑氮胞苷(5μmol/L)对脐带干细胞进行心肌细胞定向诱导并鉴定。3)在心肌细胞定向诱导培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子‑β1，采用逆转录‑聚合酶链反应(RT‑PCR)方法检测心肌特异性基因肌钙蛋白T，免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性肌球蛋白Myosin抗体和连接蛋白Connexin43抗体及细胞透射电镜检查。

【技术特征摘要】
1.本发明专利其特征是通过下列步骤进一步提高脐带干细胞体外诱导分化为心肌细胞的效率：1)分离、培养脐带干细胞并进行鉴定。2)采用诱导剂5-氮胞苷(5μmol/L)对脐带干细胞进行心肌细胞定向诱导并鉴定。3)在心肌细胞定向诱导培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测心肌特异性基因肌钙蛋白T，免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性肌球蛋白Myosin抗体和连接蛋白Connexin43抗体及细胞透射电镜检查。2.按权利要求1的方法，诱导4...

【专利技术属性】
技术研发人员：武开宏，李琳，徐飞，莫绪明，
申请(专利权)人：南京医科大学附属南京儿童医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32