心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法。该心肌分化试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3；其中，心肌分化基础培养基为含糖1640培养基，心肌分化添加剂1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1～3v％的B27。该试剂盒中不含动物源成分，分化的心肌细胞均一性好，电生理稳定，可重复性高；适用于包括药物开发和安全性评价在内的各种需求，为心血管药物开发和生理学研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及涉及生物医学
，具体而言，涉及一种心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法。
技术介绍
日本学者中山申弥(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的方法，分别成功将小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)，并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞(人诱导多能干细胞)具备hES细胞(人胚胎干细胞)的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源，为临床应用带来了新的曙光。冠心病(Coronary Artery Disease,CAD)是仅次于高血压的第二大心血管疾病，在全球范围内的发病率和死亡率非常高，近几年其发病率在我国也呈上升趋势。目前冠心病的主要临床治疗方法如药物治疗、经皮冠状动脉介入术(PCI)及冠状动脉搭桥术(CABG)，都不能显著恢复受损后的心脏功能。由于人心肌没有再生能力，一旦由于心梗等原因受损死亡后，一旦超过临界点，心脏会进入恶性代偿的循环，最终不可逆的发展进入心衰。根据中国的流行病学调查，人群中的慢性心衰患病率为0.9％，至少有1000万病人，总死亡率达32％。诱导多能干(iPS)细胞因其易扩增，可定向分化为心肌细胞，且无免疫排斥反应和伦理学问题，提供了治疗冠心病的新思路。最近的研究发现，移植人ES/iPS产生的心肌细胞后，心梗猪的心功能得到了显著程度的改善，形态学和生理学结果都显示移植的心肌整合进入宿主心脏并形成有效的收缩功能单元(Kawamura et al.,2012；Shiba et al.,2012)。人心肌细胞与常用实验动物的心肌细胞相比，存在较大生理学差异。例如，人心脏生理条件下每分钟搏动60～90次，而小鼠为500～700次，大鼠为300～400次。而获取与人心脏生理接近的大动物心肌细胞非常昂贵而且困难，收集到的细胞均一性差，难以得到稳定可靠的结果。ES/hiPS产生的心肌之前，几乎不可能获任何人源心肌细胞用于药物开发，毒性测定和生理学研究。因此，需要解决现有技术中因为心肌细胞无法长期培养和实现规模化量产，而无法用于药物开发，毒性测定和生理学研的技术问题。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法，以解决现有技术中因为心肌细胞无法长期培养和实现规模化量产，而无法用于药物开发，毒性测定和生理学研的技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种心肌分化试剂盒，该心肌分化试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3；其中，心肌分化基础培养基为含糖1640培养基，心肌分化添加剂1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1～3v％的B27。进一步地，心肌分化试剂盒还包括心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂；其中，心肌纯化基础培养基为无糖1640培养基；心肌纯化添加剂包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；优选心肌纯化添加剂包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更优选，心肌纯化添加剂包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。进一步地，心肌分化添加剂1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1.5～2.5v％的B27；更优选，心肌分化添加剂1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括2v％的B27。进一步地，心肌分化基础培养基和心肌纯化基础培养基保存在4～8℃，心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2、心肌分化添加剂3以及心肌纯化添加剂分别置于-20～-80℃保存。进一步地，心肌分化试剂盒在使用前还包括配制相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤，配制相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤包括：在2～8℃化冻心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2、心肌分化添加剂3及心肌纯化添加剂；将心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3分别与心肌分化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3；将心肌纯化添加剂与心肌纯化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌纯化培养基。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种心肌细胞的培养方法，该培养方法包括以下步骤：将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；向培养皿中依次加入心肌分化培养基1培养2～4天，心肌分化培养基3培养1～2天，心肌分化培养基2培养2～3天，得到分化细胞；其中，心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3采用上述任一种心肌分化试剂盒中的心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3配制而成。进一步地，配制心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3的步骤包括：将心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3分别与心肌分化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3。进一步地，在得到分化细胞之后，培养方法还包括对分化细胞进行心肌细胞纯化的步骤，优选对心肌细胞纯化的步骤包括：去除心肌分化培养基2，然后向培养皿中加入心肌纯化培养基，每隔一天换一次心肌纯化培养基，纯化3～4天，获得纯化后的心肌细胞；其中，心肌纯化培养基采用上述任一种心肌分化试剂盒中的心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂配制而成。进一步地，配制心肌纯化培养基的步骤包括：将心肌纯化添加剂与心肌纯化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合形成心肌纯化培养基。进一步地，在获得纯化后的心肌细胞之后，培养方法还包括维持培养纯化后的心肌细胞的步骤；优选维持培养纯化后的心肌细胞的步骤包括：将纯化后的心肌细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，并向培养皿中添加心肌分化培养基3，每隔2天换一次心肌分化培养基3，培养60～100天。应用本专利技术的技术方案，本专利技术的试剂盒中心肌分化相关培养基、纯化相关培养基成分明确，品质稳定；不含动物源成分，分化的心肌细胞均一性好，电生理稳定，可重复性高；可以达到人源心肌细胞稳定的获得和维持，并且适用于包括药物开发和安全性评价在内的各种需求，为心血管药物开发和生理学研究奠定基础。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1A至图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3；其中，所述心肌分化基础培养基为含糖1640培养基，所述心肌分化添加剂1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；所述心肌分化添加剂2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；所述心肌分化添加剂3包括1～3v％的B27。

【技术特征摘要】
1.一种心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3；其中，所述心肌分化基础培养基为含糖1640培养基，所述心肌分化添加剂1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；所述心肌分化添加剂2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；所述心肌分化添加剂3包括1～3v％的B27。2.根据权利要求1所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化试剂盒还包括心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂；其中，所述心肌纯化基础培养基为无糖1640培养基；所述心肌纯化添加剂包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；优选所述心肌纯化添加剂包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更优选，所述心肌纯化添加剂包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。3.根据权利要求2所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化添加剂1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；所述心肌分化添加剂2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；所述心肌分化添加剂3包括1.5～2.5v％的B27；更优选，所述心肌分化添加剂1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；所述心肌分化添加剂2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；所述心肌分化添加剂3包括2v％的B27。4.根据权利要求3所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化基础培养基和所述心肌纯化基础培养基保存在4～8℃，所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2、所述心肌分化添加剂3以及所述心肌纯化添加剂分别置于-20～-80℃保存。5.根据权利要求4所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化试剂盒在使用前需配制成相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基，所述配制成相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤包括：在2～8℃化冻所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2、所述心肌分化添加剂3及所述心肌纯化添加剂；将所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2以及所述心肌分化添加剂3分别与所述心肌分化基础培养基以1:40～6...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁文静，兰峰，
申请(专利权)人：北京赛贝生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11